Evidencia directa de infección viral y alteraciones mitocondriales en el cerebro de fetos de madres esquizofrénicas en alto riesgo de esquizofrenia
Segundo Mesa Castillo (segundo at infomed dot sld dot cu)
Hospital Psiquiátrico de la Habana, Cuba
DOI
http://dx.doi.org/10.13070/rs.es.1.1235
Date
2014-11-25
Cite as
Research es 2014;1:1235
licencia
Resumen

Introducción La esquizofrenia es una de las enfermedades más invalidantes de los seres humanos. A pesar de considerarse una enfermedad orgánica del cerebro, su etiología es aún pobremente conocida, sin embargo hay cada vez más evidencias que caracterizan el trastorno debido al resultado de factores genéticos y ambientales que impactan sobre el cerebro en el período prenatal. El hecho de que gemelos genéticamente idénticos puedan ser discordantes de esquizofrenia sugiere un mecanismo no genético o un mecanismo que comprende la interacción del genotipo y el medio ambiente en el período prenatal. Al final del cuarto mes de vida del feto, tiene lugar un crecimiento significativo y crítico de un derivado del ectodermo, el cerebro. Distintos factores de riesgo ambientales han sido identificados que pueden afectar el cerebro en este período: malnutrición del feto, hipoxia e infecciones virales. Objetivos La habilidad para examinar directamente estos posibles agresores es limitada en los estudios en humanos. El desarrollo del cerebro prenatal no está abierto a un escrutinio directo. El objetivo del presente trabajo se relaciona con un examen directo del cerebro y forma parte de nuestros estudios anteriores de microscopía electrónica de cerebros de fetos de madres esquizofrénicas. Materiales y Métodos Previo consentimiento informado y con la aprobación del Comité de Ética de la Institución, se obtuvieron muestras de la punta del lóbulo temporal izquierdo de dos fetos gemelos masculinos, de 16 semanas de tiempo de gestación, abortados por indicaciones médicas, de una madre esquizofrénica paranoide. Se realizaron estudios con microscopía electrónica e inmuno-electromicroscopía de las muestras obtenidas utilizando anticuerpos anti-herpes simplex hominis tipo I [HSV-1]. Resultados Se observaron dentro de los núcleos de las neuronas partículas virales incompletas similares a las encontradas en estudios anteriores en el cerebro de fetos de madres esquizofrénicas que reaccionaron en forma positiva con el anticuerpo anti-HSV1. Otro importante aspecto de estas observaciones fue la presencia de alteraciones mitocondriales en uno de los fetos estudiados. Conclusión Los hallazgos obtenidos en el presente trabajo son compatibles con alteraciones mitocondriales y una infección viral activa del sistema nervioso central por el virus HSV1 durante el segundo trimestre de embarazo en uno de los dos fetos estudiados. La importancia de este hallazgo puede tener aplicaciones prácticas en la prevención de la enfermedad teniendo en mente su relación directa con la etiología y fisiopatología de la esquizofrenia.

English Abstract

Introduction Schizophrenia is one of the most incapacitating diseases of humans. Though considered an organic brain disease, its etiology remains poorly understood, however there is increasing evidence that characterizes the disorder due to the result of genetic and environmental factors that impact on the brain in the prenatal period. The fact that genetically identical twins may be discordant for schizophrenia suggests a non-genetic mechanism or a mechanism that involves the interaction of genotype and environment in the prenatal period. At the end of the fourth month of fetal life, occurs a significant and critical growth of one structure derived from ectoderm, the brain. Different environmental risk factors have been identified that may affect the brain during this period: fetal malnutrition, hypoxia and viral infections. Objectives The ability to directly examine these potential aggressors is limited in human studies. The prenatal development of the brain is not open to direct scrutiny. The aim of this work is related to a direct examination of the brain and is part of our previous electron microscopy studies of brains of fetuses of schizophrenic mothers. Materials and Methods Previous informed consent and with the approval of the Ethics Committee of the Institution, samples from the tip of the left temporal lobe were obtained of two male twin fetuses of 16 weeks of gestational age, aborted for medical indications of a paranoid schizophrenic mother. Electron and immuno-electron microscopic studies of the samples obtained were performed using anti-herpes simplex hominis type I [HSV-1] antibodies. Results Within the nuclei of neurons incomplete viral particles were observed similar to those found in previous studies on the brains of fetuses from schizophrenic mothers who reacted positively with the anti-HSV-1 antibody. Another important aspect of these observations was the presence of mitochondrial abnormalities in one of the fetuses studied. Conclusion The findings obtained from this study are consistent with mitochondrial alterations and an active viral infection of the central nervous system by HSV1 during the second trimester of pregnancy in one of the two fetuses studied. The importance of this finding may have practical applications in disease prevention taking in mind its direct relation to the etiology and physiopathology of schizophrenia.

Introducción

Hay dos aspectos del desarrollo que pueden estar implicados en la patogénesis de la esquizofrenia: a) La presencia de factores no presumiblemente genéticos (desarrollo inestable) y b) cualquier insulto experimentado durante el desarrollo. Los insultos que están asociados con el período crítico del desarrollo del cerebro son los que más probablemente se asocien con el desarrollo de la esquizofrenia. El hecho de que gemelos idénticos puedan ser discordantes de esquizofrenia sugiere un mecanismo no genético o un mecanismo en el que participen factores genéticos y medioambientales. Una exposición diferenciada a tales factores de riesgo temprano puede contribuir al fenómeno de discordancia en los trastornos psicóticos. La hipótesis de que los virus causen esquizofrenia y otros trastornos neurológicos fue propuesta en el Siglo XVIII y aún es aceptada como una de las asociaciones más comunes [1]. En muchos estudios, la infección por el virus de la influenza y la fiebre, particularmente durante el segundo trimestre de embarazo, ha sido implicada como factores en el desarrollo de esta condición [2] [3]. Sin embargo, estudios recientes han mostrado falta de evidencia de invasión directa del feto por el virus de la influenza. Una invasión directa del embrión o del feto es poco probable que sea la causa. Aunque se ha encontrado evidencias serológicas de infección por el virus de la influencia en mujeres cuya descendencia ha padecido esquizofrenia no hay evidencias microbiológica ni histopatológica de que el virus haya infestado el feto en estos casos [4]. Una presuntiva evidencia de etiología viral de la esquizofrenia requiere de la demostración del virus, del antígeno o de anticuerpos virales. En trabajos anteriores hemos obtenido resultados que constituyen una evidencia directa en dos de tres de estos requerimientos, virus y antígeno: a) en estudios post-mortem del cerebro de pacientes esquizofrénicos adultos jóvenes b) en el cerebro de animales experimentalmente inoculados con líquido céfalo raquídeo [LCR] de pacientes esquizofrénicos c) en el lóbulo temporal de fetos de madres esquizofrénicas. Hasta nuestro reciente reporte, las evidencias que sustentaran el concepto de interacción virus-célula en la hipótesis del neurodesarrollo de la esquizofrenia habían sido indirectas. Las partículas virales nunca habían sido demostradas. En nuestros estudios de fetos de madres esquizofrénicas también hemos observado anomalías estructurales en las mitocondrias. En los últimos años las mitocondrias han sido objeto de estudio en la esquizofrenia por diferentes investigadores. Los virus se pueden localizar en las mitocondrias e irrumpir en su integridad. De esta forma, su acción, en cooperación con otros productos celulares, ya virales o inducidos, son capaces de comprometer la funcionabilidad de las membranas mitocondriales de las células infectadas. El presente trabajo se relaciona con nuestros hallazgos en el lóbulo temporal en uno de dos fetos gemelares monocigóticos procedentes de una madre esquizofrénica paranoide con fuertes antecedentes familiares de esquizofrenia. La presencia de anomalías estructurales de las mitocondrias ha sido también el objeto de este artículo. Nuestra hipótesis de trabajo fue: el cerebro de fetos de madres esquizofrénicas tendría alteraciones a nivel celular que nos permitiría diferenciarlos de cerebros de fetos normales.

Evidencia directa de infección viral y alteraciones mitocondriales en el cerebro de fetos de madres esquizofrénicas en alto riesgo de esquizofrenia Figura 1
Figura 1. Partículas virales incompletes [flecha blanca] dentro del núcleo de una neurona de un feto gemelar monocigótico de una madre y abuela esquizofrénica paranoide.
Materiales y métodos

Previo consentimiento informado y con la aprobación del Comité de Ética del Hospital Psiquiátrico de la Habana, se obtuvieron muestras de la punta del lóbulo temporal de dos fetos gemelos masculinos, (monocigóticos, monocoriónicos y biamnióticos), de 16 semanas de tiempo de gestación, abortados por indicaciones médicas, de una madre esquizofrénica paranoide. Uno de los gemelos presentaba criptorquidismo . Las muestras, una vez obtenidas, se fijaron en glutaraldehído-paraformaldehído siendo transportadas al laboratorio de microscopía electrónica para la realización de las técnicas de microscopía electrónica: técnica general para microscopía electrónica de transmisión e inmuno-electromicroscopía. Las muestras obtenidas se fijaron durante 1 hora en glutaraldehído-paraformaldehído, lavándose en buffer fosfato (PBS) durante 5 minutos en cada lavado. Posteriormente se procedió al bloqueo de la peroxidasa endógena con metanol más peróxido de hidrógeno durante treinta minutos a la temperatura ambiente. Se procedió al lavado con varios volúmenes de PBS durante 15 minutos. Lavados con TRIS, tres volúmenes de 5 minutos cada vez. Se utilizó suero normal de carnero diluído 1:5. Se añadió el antisuero anti-herpes simplex hominis tipo [1] DAKO LAB., durante 24 horas, lavándose posteriormente con TRIS ( tres volúmenes, cinco minutes cada uno. Se añadió DAB (diamino-bencidina), durante 8 minutos a temperatura ambiente, lavándose con TRIS. Se realizó la post-fijación con tetróxido de osmio al uno por ciento durante treinta minutes, lavándose con buffer fosfato (3X15 minutos), etanol al 30 por ciento durante 5 minutos, al 50 por ciento durante 5 minutos, al 70 por ciento durante 10 minutos y etanol absolute (3X20 minutos). Oxido de propileno (3X15 minutos): procediéndose a la inclusion en Epon I durante 60 minutos, Epon II durante toda la noche, terminándose la inclusion definitivamente para bloques con dilusión del antisuero 1/10 y 1/20, bloques controles de cada dilusión, bloques de los controles más control de los bloques controles en cada dilusión y técnica general.

Evidencia directa de infección viral y alteraciones mitocondriales en el cerebro de fetos de madres esquizofrénicas en alto riesgo de esquizofrenia Figura 2
Figura 2. Partículas virales incompletes [flechas blancas] e intracitoplasmáticas completas [flechas negras] marcadas con anticuerpo para el virus anti-herpes simplex hominis tipo I unido a peroxidasa. Ax=axon. Feto monocigótico.
Resultados

En uno de los fetos estudiados [el que presentaba criptorquidismo] se observó dentro del núcleo de las neuronas la presencia de partículas esféricas vacías de 100 nm ocupando el centro de un área electrón lúcida (Fig.1). Las inclusiones con partículas aparecieron en número de 2 a 8 por núcleo, con gran incidencia en su aparición. En el estudio inmuno-electromicroscópico una reacción positiva se observó contra el virus herpes simplex hominis tipo I en el núcleo y en el citoplasma de las neuronas (Fig. 2). Las partículas virales no se observaron en el resto de las células del sistema nervioso, tampoco la reacción inmunológica.

Mitocondria. Se observó un número incrementado de mitocondrias en el citoplasma de las neuronas correspondientes a la capa granular de la corteza temporal (Fig. 3). El aspecto general de las mitocondrias afectadas mostró pérdida de las membranas internas dando la apariencia de mitocondrias vacías. Estas anomalías estructurales observadas en las mitocondrias y las partículas virales no fueron observadas en el otro feto.

Evidencia directa de infección viral y alteraciones mitocondriales en el cerebro de fetos de madres esquizofrénicas en alto riesgo de esquizofrenia Figura 3
Figura 3. Neurona granular con el citoplasma completamente lleno de mitocondrias gigantes, la mayor parte vacías de crestas.
Discusion

Las evidencias acumuladas en la última década sugieren el rol de la disfunción mitocondrial en la patogénesis de la esquizofrenia, del trastorno bipolar y de otras enfermedades psiquiátricas [5] ; sin embargo no hay estudios de las mitocondrias mediante técnicas de microscopía electrónica. La mayor parte de los estudios han utilizado métodos indirectos en la búsqueda de disfunción mitocondrial en la esquizofrenia y los trastornos bipolares. Entre estos métodos se destaca la cuantificación total del DNA mitocondrial y la depleción normal con resultados contradictorios [6] [7]. La mayor parte de estos estudios se limitaron a la corteza frontal [8]. En relación a métodos de análisis directo hay pocas publicaciones. Los únicos estudios de microscopía electrónica que ofrecieron detalles en la ultraestructura del sistema nervioso en la esquizofrenia comenzaron en la década del 70. Especialmente en el estudio de embriones de madres esquizofrénicas casi todos los estudios fueron realizados por investigadores rusos [9] [10]. En estos estudios ellos destacaron las alteraciones encontradas en cerebros de embriones en diferentes estadios de evolución, desde 7 hasta 12 semanas. Las características de los cambios celulares en los cerebros de embriones consistieron en un mayor desarrollo del sistema de membranas. Las alteraciones mitocondriales fueron muy evidentes con aumento en su número, en su tamaño y con destrucción de las crestas. Ellos señalaron también la presencia de estructuras laminares que denominaron “lamelosomas” [11] [12]. Las alteraciones mitocondriales han sido interpretadas como parte de un proceso general de alteraciones de membrana en la esquizofrenia [13]. Los lamelosomas y la proliferación de membranas han sido observados en nuestros estudios en adultos esquizofrénicos, en embriones inoculados con LCR de pacientes esquizofrénicos y en el sistema nervioso de fetos de madres esquizofrénicas [14].

El rol fisio-patológico de las alteraciones mitocondriales en la esquizofrenia pudiera estar relacionado no solo con el proceso oxidativo sino también con el sistema de conducción celular debido al compromiso de las membranas. Los virus pueden interactuar con las mitocondrias. Hay diversos reportes en este sentido [15] [16] [17] [18]. La mayor parte se relacionan con el virus herpes. Particularmente el virus herpes simplex elimina el DNA mitochondrial [19]. Nosotros hemos observado partículas y antígeno de herpes simplex en las tres experiencias ya citadas: adultos esquizofrénicos, animales inoculados y fetos de madres esquizofrénicas. La hipótesis del neurodesarrollo en la etiología y fisiopatología de la esquizofrenia se considera una de las más consistentes en estos momentos [20]. Se basa en una serie de evidencias que guían hacia una afectación del feto en el período crítico del desarrollo del ser humano debido a complicaciones del embarazo y del parto, particularmente relacionadas con un impacto presunto o conocido sobre el desarrollo neurológico del feto que resulta en un incremento de riesgo de psicosis esquizofrénica. Entre los posibles candidatos etiológicos de impacto están las infecciones virales. Un virus actuando en este importante y crítico estadio de desarrollo, interactuando o no con factores genéticos puede ser responsable de la cascada de eventos biológicos que aparecen posteriormente y pudiera explicar el período de relativa quietud que existe entre el nacimiento y la aparición de los síntomas en la pubertad lo que pudiera estar relacionado con la reactivación de una infección viral latente.

Los hallazgos obtenidos en el presente trabajo son compatibles con una infección viral activa del sistema nervioso central por el virus herpes simplex hominis tipo I [1] durante el segundo trimestre de embarazo en uno de los dos fetos estudiados. Hasta nuestro reciente reporte las evidencias que sustentaran el concepto de interacción virus-célula en la hipótesis del neurodesarrollo en la esquizofrenia, habían sido indirectas. Las partículas virales nunca habían sido demostradas. Este trabajo es la primera evidencia directa que demuestra la presencia de partículas virales en el sistema nervioso central en fetos de madres esquizofrénicas en el período crítico del segundo trimestre de desarrollo fetal. La importancia de este hallazgo y las alteraciones mitocondriales pueden dar lugar a aplicaciones prácticas en la prevención de la enfermedad teniendo en mente su relación directa con la etiología y fisiopatología de la esquizofrenia. Se sugiere la posibilidad de estudiar las células del líquido amniótico por medio de técnicas virológicas o de microscopía electrónica en mujeres a riesgo de tener una descendencia de esquizofrenia con el objetivo, previo consentimiento informado, de aplicar medidas preventivas, interrupción del embarazo o tratamiento antiviral temprano, si se demuestra una infección viral en las células del líquido amniótico en estos estadios tempranos del neurodesarrollo.

Conclusiones

Cuando un agente infeccioso es observado en una enfermedad de causa desconocida se plantea siempre lo mismo: si el agente descubierto se relaciona o no con la enfermedad en cuestión. en relación a nuestros resultados: Da lugar a la interrogante si la exposición prenatal al virus observado es un factor de riesgo de sufrir esquizofrenia posteriormente. Debemos considerar:

  • 1. Puede ser una infección viral en la paciente que afectó al feto no relacionada con la etiología de la enfermedad.
  • 2. Puede ser una infección viral en el feto relacionada con la etiología de la enfermedad. En este sentido concurren varias circunstancias favorables:
    • A. Segundo trimestre de embarazo
    • B. Antecedentes familiares de esquizofrenia y de trastornos severos del neurodesarrollo
    • C. Presencia de una forma viral incompleta
    • D. Afectación de las neuronas y del núcleo principalmente
    • E. Discordancia de infección en los gemelos monocigóticos
    • F. Madre y abuela esquizofrénicas, dos tías esquizofrénicas
    • G. No signos ni síntomas clínicos de infección en la madre ni en el feto
    • H. No reacción inflamatoria en el tejido cerebral
    • I. Hallazgos previos semejantes en adultos esquizofrénicos y en animales de experimentación
    • J. Muestra de la punta del lóbulo temporal izquierdo
    • K. Relación con el virus herpes simplex hominis tipo 1
    • L. Hallazgos similares en otros fetos de madres esquizofrénicas no en controles
    • M. Hallazgos similares en la placenta en un estudio
Referencias
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