Aplicaciones de anticuerpos
Jennifer Oliver (jaoliver313 at gmail dot com)
Wayne State University, United States
Translator
Agustin Carbajal (quiocarbajal at gmail dot com)
Cordoba, Argentina
DOI
//dx.doi.org/10.13070/mm.es.3.182
Date
fecha : 2016-10-28; original version : 2013-03-31
Cite as
MATER METHODS es 2013;3:182
Resumen

Resumen de aplicaciones de anticuerpos en investigación biomédica. Claves utilizadas para las aplicaciones en las búsquedas y páginas web de Labome.

English Abstract

An overview of antibody applications in biomedical research. Application keys used in Labome searches and webpages are explained.

AplicaciónDetalleClaves de Labome
Western Blot tipo de gel: reductor, nativo
tipo de lisado: lisado celular, lisado tisular, muestra de lisado de inmunógeno sobreexpresado
WB
Western de célula únicascWB
Isoelectroenfoque con sondaPIF
Inmunohistoquímicafijación: acetona, etanol, formalina/formaldehído/paraformaldehído, metanol, microonda, calentamiento
Imbibición: acrílicos/plásticos, ver abajo
IH
Imbibición: parafinaIHC-P
Imbibición: congeladaIHC-F
Seccionamiento por flotación libreIHC-Free
InmunocitoquímicaIC
Ensayo de ligado por proximidadPLA
Western en célula ICW
Citometría de flujoFC
Clasificación celularFACS
InmunoprecipitaciónIP
inmunoprecipitación de cromatina ChIP
Secuenciación de inmunoprecipitación de cromatinaChIP-Seq
Inmunoprecipitación de ARNRIP
Inmunoprecipitación con entrecruzamientoCLIP
Inmunoensayo
ELISA ELISA
RadioinmunoensayoRIA
Enzimoinmunoensayo EIA
Inmuno-PCRI-PCR
Ensayo funcional
ActivaciónA
Bloqueo/neutralizaciónNeut
Ensayo de cambio de la movilidad electroforéticaEMSA
espectrometría de masasMS
Estándares de isótopos estables y captura por anticuerpos anti péptidoSISCAPA
Inmuno-MRMI-MRM
Inmuno-MALDIiMALDI
Inmunoensayo de espectrometría de masasMSIA
Tabla 1. Principales aplicaciones de anticuerpos y sus claves en Labome.

En la investigación biomédica, el anticuerpo realmente es un caballo de batalla. Los anticuerpos son altamente sensibles y específicos para determinados epítopes, lo que los hace reactivos ideales para aplicaciones de investigación. Adicionalmente, la biotecnología moderna ha facilitado la producción a gran escala de anticuerpos. Alrededor de 1890, los anticuerpos eran descriptos por primera vez por Behring y Kitasato, quienes determinaron que toxinas inactivas inducían inmunidad protectora contra toxinas activas en animales y que inyecciones de suero de esos animales protegidos podían transferir la protección a otros animales. Por esta razón, los anticuerpos se describieron inicialmente como "antitoxinas"; sin embargo, mas adelante se descubrió que los anticuerpos tienen un repertorio de reconocimiento de antígenos mucho mayor [1].

De acuerdo a la definición mas simple, un anticuerpo es la forma soluble del receptor de antígeno del linfocito B, y los anticuerpos son producidos exclusivamente por linfocitos B. En ratones y humanos existen cinco isotipos de anticuerpos, los cuales se distinguen por la estructura de la inmunoglobulina, y se componen de dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas. Estas cadenas se encuentran unidas por puentes disulfuro, los cuales proveen cierto grado de flexibilidad a la molécula en su conjunto. La porción de la molécula sin las cadenas livianas es conocida como la región constante o Fc (fragmento cristalizable); esta región es determinada por un set fijo de genes y es idéntica para todos los anticuerpos de un dado isotipo de una dada especie. La porción que incluye tanto las cadenas pesadas y livianas unidas se conoce como la región variable o Fab (del inglés, "antigen binding fragment" -fragmento que une al antígeno-); los extremos de esta región contienen sitios hipervariables que reconocen y unen al epítope del antígeno blanco. La región Fab también es determinada por un set fijo de genes, pero son necesarias mutaciones somáticas adicionales para generar los sitios hipervariables únicos y altamente específicos (figura 1). [1, 2].

Aplicaciones de anticuerpos Figura 1
Figura 1. Representación esquemática de la estructura molecular de un anticuerpo. Las barras rojas indican puentes disulfuro que unen las cadenas pesadas entre ellas y con las cadenas livianas.

Hoy en día, los anticuerpos son producidos en animales o células animales. Tanto anticuerpos monoclonales (isotipo y especificidad de antígeno homogéneas) como policlonales (isotipo y especificidad de antígeno heterogéneas) se encuentran disponibles comercialmente y en laboratorios individuales. Los anticuerpos policlonales son aislados del suero de animales que han sido inmunizados contra el antígeno blanco. Si bien los anticuerpos policlonales suelen ser específicos para un antígeno, contienen una mezcla de diferentes anticuerpos contra diferentes epítopes del mismo antígeno y también pueden contener anticuerpos contra proteínas no relacionadas, lo que puede afectar los resultados del ensayo. Adicionalmente, el suministro de un anticuerpo policlonal depende del animal que lo produzca y, por ende, no habrá dos lotes de anticuerpos policlonales contra un antígeno particular que sean iguales. Por otro lado, los anticuerpos monoclonales son obtenidos a partir de hibridomas, los cuales son líneas clonales inmortalizadas generadas a partir de la fusión entre un linfocito B de un ratón inmunizado con una célula de mieloma de ratón, o un par mas de especies. Estas células pueden producir un suministro continuo de anticuerpos homogéneos y son el estándar actual para la tecnología de producción de anticuerpos.

MétodoNúm
Western blot57139
inmunohistoquímica41630
citometría de flujo24872
inmunocitoquímica17825
inmunoprecipitación4939
ChIP/ChIP-seq3238
bloqueo o activación2847
ELISA2832
EMSA479
Tabla 2. El número (Núm) de publicaciones que citan una aplicación de anticuerpo específica en 38.430 publicaciones revisadas por Labome.
Detección y aislamiento de proteínas
Inmunoprecipitación

En ensayos de inmunoprecipitación, también conocidos como ensayos de "pull down" (tirar para abajo), los anticuerpos son utilizados para marcar y precipitar o "tirar para abajo" los antígenos blanco a partir de un lisado celular, un fluido biológico u otra solución acuosa. El proceso de precipitación es facilitado por diferentes tipos de esferas (por ej. magnéticas, de agarosa, de sefarosa) que unen la región Fc del anticuerpo, lo cual a su vez permite separar los complejos antígeno-anticuerpo del lisado total mediante centrifugación u otros métodos mecánicos (figura 2) [3].

Los ensayos de inmunoprecipitación son populares en muchas aplicaciones de investigación en biología celular y molecular. En el nivel mas básico, la inmunoprecipitación puede ser utilizada para purificar el antígeno blanco para su uso posterior en investigación. La inmunoprecipitación también es utilizada comúnmente para determinar las interacciones entre múltiples proteínas en células homeostáticas o en células que han sido sometidas a algún tratamiento en particular. En tales ensayos, un anticuerpo contra la primer proteína sería utilizado para el paso de precipitación, y ensayos posteriores tales como Western blot (ver mas abajo) serían utilizados para determinar si la segunda proteína ha precipitado junto con la primera.

Aplicaciones de anticuerpos Figura 2
Figura 2. Esquema procedimental de un ensayo estándar de inmunoprecipitación. Reimpreso con permiso de Pierce Protein Biology Products, Thermo Scientific.
Ensayos de inmunoadsorción

Los ensayos por inmunoadsorción ligado a enzimas (del inglés, ELISA) son utilizados para analizar cuali y cuantitativamente la presencia o concentración de un antígeno soluble en particular tal como un anticuerpo específico, o un péptido en muestras líquidas, tales como fluidos biológicos y sobrenadantes de cultivos celulares. Estos ensayos hacen uso de la habilidad de los platos de poliestireno para unir proteínas, incluyendo anticuerpos, así como las especificidades particulares de los anticuerpos por sus antígenos blanco. Generalmente, estos ensayos incorporan un punto final colorimétrico que puede ser detectado mediante la absorbancia a una determinada longitud de onda y cuantificado a partir de una curva estándar de diluciones de antigeno o de anticuerpo. Existen tres formatos de ELISA comúnmente utilizados.

Aplicaciones de anticuerpos Figura 3
Figura 3. Esquema procedimental de un ensayo estándar de ELISA sándwich directo.
ELISA directo

Los ELISA directos utilizan cantidades conocidas de anticuerpos monoclonales para determinar la concentración de un antígeno en particular en una solución. Por ejemplo, el ELISA directo puede determinar la concentración de una citoquina secretada por una población celular luego de ser estimulada o inhibida, midiendo la cantidad de citoquina en el sobrenadante de cultivo. Los ELISA directos suelen ser realizados de acuerdo al método "sándwich", en el cual el antígeno blanco se encuentra en el medio de dos anticuerpos monoclonales que unen diferentes epítopes del mismo antígeno. El anticuerpo de "captura" es utilizado para cubrir los pocillos del plato de ensayo. Luego de lavar y bloquear, la solución a medir es agregada a los pocillos para permitir la "captura" del antígeno específico, si es que se encuentra presente. Una vez que se lava el exceso, se agrega el anticuerpo de "detección", el cual suele estar unido a biotina, a los pocillos. Luego se agrega un complejo estreptavidina-enzima el cual se une al anticuerpo de detección biotinilado. Finalmente se agrega a los pocillos un substrato colorimétrico para la enzima. La cuantificación relativa puede ser medida por simples cambios de color en los pocillos del ensayo: mientras mas alto sea el cambio de color, mas alta es la concentración del antígeno en la muestra. La cuantificación absoluta puede ser realizada con una curva estándar que es generada con pocillos con cantidades conocidas del antígeno blanco. Este proceso también puede ser realizado sin el anticuerpo de captura; en otras palabras, el antígeno puede ser unido directamente a los pocillos. Sin embargo, el método sándwich es mas especifico gracias al uso del sistema dual de anticuerpos [4] (Figura 3).

Aplicaciones de anticuerpos Figura 4
Figura 4. Esquema procedimental de un ensayo de ELISA con inhibición por competición.
ELISA indirecto

Los ELISA indirectos son utilizados para medir la cantidad de un anticuerpo específico para antígeno en una solución. En este ensayo un antígeno específico se une directamente a los pocillos del plato de ensayo. La solución que puede contener el anticuerpo (por ej. suero sanguíneo, medio de cultivo de hibridoma) es agregada a los pocillos para permitir la unión del anticuerpo al antígeno. A continuación, un anticuerpo secundario unido a una enzima, el cual es específico para la región Fc del anticuerpo desconocido, es agregado a los pocillos, en donde se adhiere a los anticuerpos que se encuentran unidos al antígeno en el plato. Finalmente un substrato colorimétrico es agregado, el cual es escindido y alterado por la enzima unida, y la presencia del anticuerpo en cuestión es determinada mediante lecturas de absorbancia.

ELISA competitivo

Los ELISA competitivos suelen ser utilizados para detectar pequeños antígenos. En estos ensayos, la muestra con concentraciones desconocidas del antígeno blanco son añadidas a los pocillos, los cuales han sido recubiertos con concentraciones conocidas del mismo antígeno blanco. Un anticuerpo de detección marcado específico contra el antígeno blanco es entonces agregado a los pocillos. Los complejos solubles antígeno-anticuerpo son lavados, y la cantidad de anticuerpo unido al antígeno del plato es determinada [5]. La señal generada por los ELISA competitivos es opuesta a aquella generada por otros ELISA. Específicamente, mientras mas baja sea la señal, mas alta será la concentración del antígeno en la muestra, dado que el antígeno libre inhibió la unión del anticuerpo al antígeno unido al plato (figura 4) [4].

Aplicaciones de anticuerpos Figura 5
Figura 5. ELISPOT. A, esquema procedimental. B, imágenes representativas de pocillos de ELISPOT. Esplenocitos de un ratón vacunado fueron estimulados o no con el antígeno blanco por 48 horas; las células fueron removidas y posteriormente los pocillos fueron teñidos con el anticuerpo de detección y un reactivo colorimétrico.
Ensayos ELISPOT

Los ensayos ELISPOT son similares a los ELISA sándwich en el hecho de que la citoquina detectada u otro factor soluble es capturado por un anticuerpo monoclonal, el cual se encuentra unido al plato de ensayo y es detectado por un segundo anticuerpo monoclonal que se encuentra unido a una molécula que facilita la detección colorimétrica. Sin embargo en un ensayo ELISPOT, las células productoras de citoquinas son cultivadas directamente en platos de ensayo recubiertos por anticuerpo de captura y bloqueados, lo cual permite la captura de citoquinas de células individuales en un punto. Las células son descartadas luego de un período de tiempo de cultivo definido, y el resto del ensayo es realizado de una manera muy similar al ensayo de ELISA. Sin embargo, el paso colorimétrico final no es analizado por detección de longitud de onda sino mediante la detección visual ya sea bajo un microscopio con un lector de plato especializado. Un ensayo exitoso de ELISPOT de células productoras de citoquinas resultará en un gran número de puntos coloreados en cada pocillo, y cada punto debería corresponder a una única célula. Los ensayos de ELISPOT son particularmente útiles para la detección de respuestas de poblaciones de células muy pequeñas tales como células T específicas de antígeno de un ratón vacunado que pudieran no ser fácilmente detectables mediante otros tipos de análisis (figura 5).

La tecnología de inmunoadsorción también puede ser utilizada en combinación con la tecnología de microarreglos para obtener arreglos de proteómica funcional de alto rendimiento. En estos ensayos, portaobjetos de vidrio o poliestireno son recubiertos con anticuerpos de captura o muestras (por ej. lisados celulares). El primero es similar a un ELISA de sándwich clásico o ELISPOT ya que el antígeno es unido entre anticuerpos unidos al plato y anticuerpos libres, y el segundo es similar al ELISA directo ya que el antígeno blanco se une directamente al portaobjeto. Los anticuerpos de detección para ambos son específicos para antígenos conocidos y se encuentran marcados fluorescentemente. Esta tecnología puede encontrar alteraciones en la concentración de proteínas y estado de activación de manera relativamente rápida [6, 7].

Aplicaciones de anticuerpos Figura 6
Figura 6. Western blot. A, esquema procedimental. B, imágenes representativas. Células T CD8+ fueron estimuladas con anticuerpos entrecruzados contra el receptor de células T y el receptor coestimulatorio CD28 por los períodos de tiempo indicados previo a la lisis y Western blot con los anticuerpos indicados.
Inmuno-PCR

La inmuno-PCR (I-PCR) es una técnica que combina la sensibilidad de la amplificación de ácidos nucleicos por PCR con la especificidad de los ensayos basados en anticuerpos, resultando en un incremento de la sensibilidad de detección. Típicamente, es posible obtener un incremento de entre 100 a 10.000 veces respecto del límite de detección del ELISA en varias aplicaciones. La inmuno-PCR fue descripta por primera vez en 1992 por Sano et al. [8]. A pesar del potencial de esta técnica, el uso de I-PCR en aplicaciones de diagnóstico y biomédicas fue limitado por varios años a causa de algunos problemas que comprenden la duración del ensayo y, como consecuencia, el incremento de la tasa de error. Mas aún, uno de los principales inconvenientes fue la dificultad para unir los anticuerpos a los oligonucleótidos. Se han propuesto varias soluciones, tales como métodos de conjugación rápidos y eficientes (por ej. el sistema de conjugación anticuerpo-oligonucleótido Thunder-Link® de Innova Biosciences). Además, la introducción de técnicas de alto rendimiento y PCR múltiples en simultaneo mejoraron notablemente la I-PCR, la cual actualmente se usa de rutina como prueba de diagnóstico para algunos patógenos bacterianos y virales, y para la detección de marcadores de tumores y de contaminación en comida [9]. La combinación de PCR cuantitativa con I-PCR (qI-PCR) permitió la cuantificación de biomarcadores de baja abundancia en muestras biológicas complejas, los cuales son complicados de detectar mediante inmunoensayos clásicos [10].

Técnicas de blot para proteínas
Western blot

El Western blot es un método en el cual las proteínas que han sido separadas electroforéticamente en un gel son transferidas a una membrana absorbente mediante una carga eléctrica. Una vez en el papel, las proteínas pueden ser detectadas con anticuerpos específicos marcados.

La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (del inglés, SDS-PAGE) es realizada para detectar proteínas que han sido desnaturalizadas por el SDS (dodecilsulfato de sodio). Sin embargo, algunos anticuerpos específicos no reconocen su epítope blanco en una proteína desnaturalizada y, por ende, se puede realizar una electroforesis en gel de poliacrilamida nativa sin SDS [11].

La transferencia puede ser realizada mediante el método húmedo, semiseco o seco. En el método húmedo el gel es colocado entre la membrana de transferencia y varios filtros y es sumergido en un tanque lleno de un búfer específico de transferencia, tal como el Tris-glicina. En el método semiseco, el gel es colocado en un formato similar al anterior pero es humedecido con una pequeña cantidad de búfer y es colocado directamente entre los electrodos. Finalmente, en el sistema seco no se requiere búfer y en cambio se utilizan apilamientos preensamblados listos para usar conteniendo electrodos, matrices de búfer y membrana. Si bien el método seco es mas rápido, el método húmedo provee resultados mas consistentes y requiere menos de la resolución de problemas, ya que el método semi seco requiere de un ensamblado cuidadoso de todos los componentes [11]. Mas aún, proteínas de menor peso pueden atravesar la membrana en transferencias semi secas muy largas [12].

Una vez transferidas y bloqueadas para reducir la unión de proteínas no especifica, las membranas son incubadas con un anticuerpo primario que es específico para la proteína de interés. Anticuerpos monoclonales suelen tener mayor especificidad; sin embargo, muchos de estos anticuerpos son generados contra fragmentos peptídicos mas que contra la proteína nativa y por ende pueden no ser efectivos en la detección de proteínas separadas por electroforesis en gel de acrilamida nativo. Anticuerpos policlonales también pueden ser utilizados, pero pueden dar lecturas mas altas del fondo. Dado que los anticuerpos primarios no suelen estar marcados, un anticuerpo secundario específico de especie para la porción Fc del anticuerpo primario puede ser utilizado para el paso de detección. La mayoría de las veces, el anticuerpo secundario se encuentra marcado con una enzima. Las membranas marcadas con enzima pueden ser visualizadas incubándola en un substrato enzimático quimioluminiscente, seguido de la exposición a una película autorradiográfica. Las proteínas marcadas positivamente aparecerán como bandas obscuras en la película (figura 6).

Dot blot

El dot blot es similar al Western blot en que las proteínas son detectadas sobre una membrana; sin embargo, para los dot blots las proteínas no han sido separadas electroforéticamente. En cambio, las muestras conteniendo proteínas son aplicadas directamente sobre la membrana ("dot" en inglés significa "punto"). Este no es un método totalmente cuantitativo, pero puede ser útil para detectar la presencia o ausencia de proteínas específicas; por ejemplo, el dot blot puede ser utilizado para detectar la localización de ciertas proteínas en la separación de lisados celulares en gradiente de sacarosa [13].

Aplicaciones de anticuerpos Figura 7
Figura 7. Isoelectroenfoque con sonda. Esquema procedimental. De [14], derechos de autor por PNAS.
Isoelectroenfoque con sonda

Proteínas en muy baja el cantidad (tan poco como 25 células [14] ) son separadas mediante isoelectroenfoque capilar e inmovilizadas en el capilar, y subsiguientemente detectadas a través de anticuerpos primarios específicos y quimioluminiscencia [14] (Figura 7).

Western blot de célula única

Un artículo publicado por Hughes et al. en la revista Nature Methods destaca una nueva y rápida técnica de "inmunobloting" para el análisis de proteínas [15]. Este método de Western blot de célula única incorpora tantos aspectos de microfluídos como de microarreglos. Los autores describen la construcción de portaobjetos recubiertos en gel de poliacrilamida en los cuales se imprimen micropocillos, permitiendo así a las células suspendidas encima asentarse en los pocillos en una densidad aproximada de 1 célula/pocillo. Una vez en los pocillos, las células son lisadas y sometidas brevemente a electroforesis. Las proteínas separadas son entonces entrecruzadas al gel (un paso que brinda estabilidad superior evidenciada mediante ciclos repetidos de limpieza y resondeo del gel), teñidas con anticuerpo primario y secundario marcado con fluorocromos de manera similar al Western blot convencional, y visualizadas mediante microscopía fluorescente. Si bien éste es el primer reporte del método y cuestiones tales como la difusión de los lisados celulares desde los pocillos y la consiguiente pérdida de proteína permanecen sin resolver, esta técnica representa un paso valioso en el análisis de proteínas por las siguientes razones. Primero, la naturaleza del ensayo de célula única o casi célula única evita el enmascaramiento de la variabilidad intercelular dentro de una población celular macroscópicamente homogénea. Segundo, se determinó que el Western blot de célula única pose alta sensibilidad y especificidad, en particular con respecto a la unión del anticuerpo a proteínas diferentes a su blanco, lo que no podía ser distinguido utilizando otros métodos de análisis de proteína de célula única tales como la citometría de flujo o la ICC. Tercero, esta técnica provee las ventajas de la detección por anticuerpo y en base al tamaño asociadas con el Western blot para muestras que, de otra manera, serían de una cantidad muy limitada para el análisis convencional. Una vez optimizado, este diseño basado en microarreglos permitirá la aplicación de experimentos funcionales o morfológicos que son generalmente analizados mediante Western blot convencional así como escenarios de screening de alto rendimiento.

Aplicaciones de anticuerpos Figura 8
Figura 8. Esquema procedimental de inmunoprecipitación de cromatina.
Determinación de interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos
Inmunoprecipitación de cromatina
IP de cromatina (del inglés, ChIP)

El ChIP fue desarrollado originalmente alrededor de 1980 para evaluar las interacciones de la polimerasa II de ARN con sus genes blanco [16]. En este procedimiento, las células son fijadas en formaldehído o un fijador similar para entrecruzar el ADN celular y sus proteínas asociadas. Las células fijadas luego son sonicadas para fragmentar los complejos ADN-proteína en fragmentos de 100-300 pares de bases (pb) y luego los fragmentos son inmunoprecipitados de acuerdo a métodos estándar con un anticuerpo específico para la proteína de interés tal como una histona o un factor de transcripción. En el paso final, los complejos ADN-proteína son disociados mediante una inversión del entrecruzamiento y los fragmentos de ADN unidos son identificados mediante análisis de PCR. Al mismo tiempo, las proteínas coprecipitadas junto con el ADN pueden ser identificadas mediante espectrometría de masas [17]. Idealmente, el método estándar de ChIP es utilizado para confirmar una asociación sospechada entre una proteína y un gen blanco putativo, debido al requerimiento de diseño de cebadores de PCR específicos (figura 8) [18].

Una limitación del ChIP es la posibilidad de que el paso de entrecruzamiento pueda alterar el antígeno blanco y por ende evite la unión del anticuerpo y la inmunoprecipitación. En tal caso, el ChIP puede ser intentado sin el paso de entrecruzamiento; este procedimiento es conocido como inmunoprecipitación de cromatina nativa o N-ChIP [16, 19]. Si bien la eliminación del entrecruzamiento puede mejorar el reconocimiento del antígeno, en general solo es útil si se conoce que la proteína blanco se une fuertemente al ADN.

ChIP-en-Chip

Mas recientemente, el ChIP ha sido modificado para su uso en análisis de alto rendimiento. Por ejemplo, el ChIP-en-Chip combina la técnica del ChIP con la tecnología de los microarreglos para permitir el análisis de todo el genoma en secuencias marcadas fluorescentemente. En estos ensayos, el ADN precipitado y el ADN control (generalmente el material de partida sin precipitar) son marcados con diferentes fluorocromos y son hibridizados a un chip de microarreglos de ADN de un loci en particular o inclusive oligos de un genoma pequeño completo. Los microarreglos pueden ser analizados mediante técnicas estándar para proveer información detallada sobre el sitio de unión para la muestra de ChIP en relación al ADN control.

ChIP-seq

El ChIP-seq combina el ChIP con las tecnologías de secuenciación modernas de alto rendimiento para facilitar la identificación de genes blanco previamente no identificados. Dado que la secuenciación de última generación ("next generation sequencing") puede proveer análisis de alta resolución de grandes cantidades de material genético, el ChIP-seq es el método de elección para análisis de ChIP de genomas grandes [20].

Inmunoprecipitación con entrecruzamiento (del inglés, CLIP)

La inmunoprecipitación con entrecruzamiento (CLIP) es una metodología desarrollada primeramente por Ule et al. en el 2003 en su estudio sobre interacciones entre los factores de splicing NOVA y una proteína de unión a ARN (RBP) específica de neuronas [21]. Es similar a aquella del ChIP; sin embargo hay algunas diferencias notables. En el CLIP, el agente entrecruzante sugerido es la irradiación UV. La sonicación no es requerida dada la menor longitud de los transcriptos de ARN, y las células pueden ser lisadas en un búfer estándar. Sin embargo, todos los lisados deben ser tratados con ARNasa para proteger los transcritos de interés. En 2008 el CLIP se acopló a la secuenciación de alto rendimiento, generando el HITS-CLIP, también conocido como CLIP-seq [22]. Tal como las técnicas de ChIP permiten el análisis de las interacciones ADN-proteína, el CLIP permite el análisis de las interacciones ARN-proteína haciendo un mapa del sitio de unión a ARN en una escala de genoma completo. El HITS-CLIP en particular ha sido ampliamente utilizado para determinar los sitios de interacción entre proteína y ARN de varios factores de splicing, tales como PTB [23], FOX2 [24], y Argonauta [25]. Sin embargo, el HITS-CLIP presenta algunos inconvenientes relacionados a la eficiencia del entrecruzamiento y la determinación precisa de los sitios de unión de la RBP. Para sobrellevar estos problemas, en 2010 Hafner et al. desarrollaron el entrecruzamiento fotoactivable de ribonucleósido mejorado e inmunoprecipitación (del inglés, PAR-CLIP) [26] y en 2011 Konig et al. propusieron el CLIP con resolución de nucleótido individual (iCLIP) que permite una resolución a nivel de un nucleótido en los sitios de unión de la RBP [27].

Inmunoprecipitación de ARN

La inmunoprecipitación de ARN (del inglés, RIP) es una metodología similar al ChIP, en la cual se caracterizan las interacciones entre proteínas y secuencias específicas de ARN [28]. Los pasos principales incluyen i) el tratamiento de células vivas con formaldehído para la formación de entrecruzamientos reversibles entre proteínas y ARN; ii) la inmunoprecipitación de una proteína de interés utilizando un anticuerpo específico; iii) la inversión del entrecruzamiento; iv) la recuperación y el análisis de las moléculas de ARN asociadas mediante RT-PCR. El RIP puede ser asociado con microarreglos (RIP-chip), como descrito por primera vez en 2006 [29], o con técnicas de secuenciación de última generación (RIP-seq), permitiendo un análisis en profundidad rápido y preciso de las moléculas de ARN y de las RBP, elementos clave en la regulación de la expresión génica a lo largo de varios procesos tales como el splicing, la edición, estabilidad y translocación del ARN.

Supercambio EM

Los ensayos de cambio de movilidad electroforética (del inglés, EMSA) son realizados para determinar las afinidades de proteínas de unión a ADN para sitios específicos de ADN [30]. En un EMSA clásico, fragmentos de ADN marcados radioactivamente conteniendo el sitio de interés son incubados con proteínas de interés. La afinidad de unión relativa es determinada por un cambio hacia arriba del ADN cuando es sometido a una electroforesis en gel, ya que la proteína unida incrementa el peso molecular asociado con el ADN y por ende causa una progresión mas lenta a lo largo del gel. Para mejorar la especificidad, un anticuerpo específico para la proteína de interés también puede ser añadido a la reacción; de unirse, el anticuerpo adicional disminuirá aún mas la migración del complejo de ADN-proteína en el gel en un proceso que es conocido como supercambio de la movilidad electroforética ("EM supershift) [31].

Aplicaciones de anticuerpos Figura 9
Figura 9. Esquema procedimental e imagen representativa de inmunohistoquímica. El ganglio mientérico del ratón fue inmunomarcado y observado por microscopía confocal. Verde, marcación de tirosina hidroxilasa. Azul, autofluorescencia. Distribuido por Swharden bajo licencia Creative Commons.
Detección in situ

La inmunohistoquímica (del inglés, IHC) e inmunocitoquímica (del inglés, ICC) son dos métodos que son utilizados rutinariamente para evaluar tanto a la presencia como la localización de proteínas in situ dentro de tejidos y células. Los métodos difieren principalmente en la preparación de la muestra; la inmunohistoquímica es realizada sobre secciones de tejido completo fijado y montado, mientras que la inmunocitoquímica es realizada sobre células que han sido removidas del estroma (por ej. células sanguíneas que se han adherido a portaobjeto mediante centrifugación o un cultivo celular en monocapa que ha sido crecido sobre un cubreobjeto) (figura 9). Una variación de la inmunocitoquímica es el ensayo de Western en célula (WEC) [32]. Durante un WEC, células crecidas en un plato multipocillo son fijadas de incubadas con anticuerpos primarios de la misma manera que en la inmunocitoquímica, y la unión del anticuerpo suele ser detectada mediante fluorescencia cercana al infrarrojo con anticuerpos primarios o secundarios conjugados (tales como DyLight® 680 or 800) para evitar la auto fluorescencia de células y platos. La señal de cada pocillos suele ser normalizada con otro colorante cercano al infrarrojo con una longitud de onda de emisión diferente tal como DRAQ5 [33, 34] para comparar. Sólo anticuerpos que han sido validados en inmunocitoquímica (nota: no Western blot) pueden ser utilizados en un WEC para asegurar que los anticuerpos y la detección son específicos.

Métodos de fijación

Existen varios métodos de fijación comunes para tejidos y células pensados para análisis de IHC o ICC, y la elección del método de fijación depende del tipo de análisis. Muestras de tejido completo que serán analizadas por IHC suelen ser fijadas en formaldehído, un agente de entrecruzamiento semi reversible que es generado a partir de paraformaldehído y que puede ser diluido a formalina. Si bien varios reportes han notado efectos negativos en muestras debido a la sobrefijación en formaldehído, otros reportes aseguran que no hay tales efectos negativos y en cambio advierten contra no permitir suficiente tiempo de fijado para que el formaldehído entrecruce las proteínas celulares. La fijación de tejido completo en formaldehído o, en algunos casos inclusive animales completos, se logra sumergiendo el tejido en una solución de trabajo de formaldehído (por ej. 4% v/v en agua). En preparaciones de retina o neuronas pueden formarse gotas luego de la fijación en formaldehído [35], y se puede añadir sacarosa a las soluciones de fijado para prevenir su formación [35].

Los alcoholes, particularmente metanol y etanol, suelen ser utilizados para fijar células para ICC o para aplicaciones en las cuales el ADN no debe ser dañado. Los alcoholes en general no se recomiendan para tejidos sólidos, ya que se cree que no preservan la morfología del tejido tanto como el formaldehído [36]. Adicionalmente, la fijación con alcohol puede llevar al encogimiento del tejido. La acetona es utilizada con menos frecuencia como fijador, y es recomendada para la fijación de tejidos congelados instantáneamente, ya que mejora la detección de epítopes, o como paso secundario luego de la fijación con metanol [37]. Sin embargo, la fijación con acetona también puede resultar en el encogimiento del tejido. Finalmente para aplicaciones en las cuales la preservación del antígeno es esencial, los tejidos pueden ser congelados instantáneamente en isopentano previamente enfriado con nitrógeno líquido y almacenado a -80 °C hasta su procesado.

MétodoIndicacionesVentajas y desventajas
Basados en formaldehídoTejidos completos
  • Simple y económico
  • Mejora la duración a largo plazo de las muestras
  • Puede modificar algunos epítopes (ver Recuperación de Epítopes)
AlcoholCélulas para análisis de ICC
  • No entrecruza muestras de ADN
  • No recomendado para tejidos completos ya que la preservación de la morfología del tejido es incompleta
  • Puede causar un encogimiento de la muestra
AcetonaTejidos congelados o secundario a la fijación con metanol
  • Puede proveer una mejor fijación que el congelamiento instantáneo por si solo
  • Puede causar un encogimiento de la muestra
Congelamiento instantáneoPreservación esencial de epítopes de antígenos
  • Rápidamente preserva los epítopes de los antígenos
  • Debe ser mantenido congelado para preservar el tejido, lo que presenta problemas de almacenamiento a largo plazo
Tabla 3. Métodos de fijación de inmunohistoquímica e inmunocitoquímica.
Métodos de imbibición

Previo al seccionamiento y a la tinción, los tejidos deben ser embebidos en un substrato. La parafina suele ser utilizada para embeber secciones de tejido completo. Dado que la parafina es hidrofóbica, los tejidos primero deben ser deshidratados mediante una serie de incubaciones en concentraciones crecientes de etanol. El penúltimo paso previo a la perfusión en parafina es la incubación en xilenos para deshidratar completamente los tejidos. Luego de que los tejidos son perfundidos por un tiempo corto con parafina, pueden ser colocados (generalmente dentro de un cassette plástico) en un baño de parafina 65 % y luego en un molde para endurecer en bloques pequeños que pueden ser seccionados en un micrótomo. La imbibición en parafina es popular debido a su relativa facilidad, bajo costo, durabilidad a largo plazo y disponibilidad. Sin embargo, la imbibición en parafina tiene sus desventajas, de las cuales no es la menos importante la inhabilidad de cortar secciones muy angostas (<5 um). Para microscopía optica de alta resolución y para microscopía electrónica, la imbibición plástica puede ser una mejor opción, ya que permite cortar en secciones muy angostas y puede ayudar a retener la forma del tejido. Adicionalmente el plástico puede permitir una imbibición y seccionamiento mas exitosos de tejidos muy duros, tales como el hueso. Sin embargo, el plástico se encuentra menos disponible y es mas costoso que la parafina, y puede interferir con algunos protocolos de tinción. Tejidos que han sido previamente congelados de manera instantánea pueden ser embebidos en compuesto de temperatura de corte óptima ("optimal cutting temperature compound", OCT), el cual es una solución de glicoles y resinas solubles en agua. El OCT deja muy poco residuo y por ende provee una señal de fondo muy baja, lo cual es ideal para la inmunotinción de tejidos congelados. Una desventaja considerable del OCT es su opacidad cuando se congela, lo cual presenta dificultades con respecto a la posición correcta de los tejidos congelados para su seccionamiento.

Método Indicaciones Ventajas y desventajas
ParafinaTejidos fijados con formaldehído
  • Facilidad y disponibilidad de la tecnología
  • Buen almacenamiento a largo plazo de bloquees de tejidos en parafina
  • Medio blando puede no permitir el seccionamiento fino
  • La fijación requerida puede dañar los epítopes.
PlásticoTejidos muy duros o que deben ser cortados muy finos (por ej. muestras para microscopía electrónica)
  • La rigidez del medio permite el corte estable de secciones muy finas (~1 m) o de tejidos duros (por ej. el hueso)
  • Mas costoso
  • Puede interferir con algunos protocolos de tinción
Medio de temperatura de corte óptima (OCT)Tejidos congelados instantáneamente
  • Poco residuo o señal de fondo
  • Su opacidad conlleva dificultad para posicionar correctamente los tejidos para su seccionado.
Tabla 4. Métodos de imbibición de tejidos para inmunohistoquímica.
Recuperación de epítope

Si bien la fijación en formalina posee muchas ventajas, puede alterar las estructuras tridimensionales de los epítopes de los antígenos. La recuperación de epítope inducida por calor (del inglés, HIER) puede ser utilizada en muestras montadas sobre portaobjeto para revertir este proceso. Estos métodos generalmente emplean tanto calor como una solución ácida o básica; tradicionalmente los portaobjeto son calentados en un búfer de citrato de sodio de pH 6, aunque búferes de pH alto son mas efectivos para la recuperación de algunos antígenos. Los portaobjetos y el búfer pueden ser calentados en un baño de agua muy caliente, una olla a presión o un autoclave, o un microondas, dependiendo de la disponibilidad de equipo. El proceso de recuperación fue examinado en detalle con espectrometría de masas MALDI-TOF, y se descubrió que secuestrantes de formaldehído son agentes de recuperación de antígeno novedosos [38].

Marcado/detección

Las muestras montadas pueden ser teñidas mediante muchos métodos. La tinción colorimétrica con anticuerpos unidos a enzimas y sustratos colorimétricos es utilizada comúnmente. Este método es relativamente simple, las reacciones colorimétricas generalmente son estables, y los portaobjetos pueden ser analizados por microscopía estándar. Sin embargo, la actividad enzimática endógena o la unión inespecífica de reactivos marcados con estreptavidina a biotinas endógenas puede elevar la señal de fondo, y generalmente sólo uno o dos antígenos pueden ser marcados por muestra. Respecto a esto, la inmunofluorescencia, o el uso de anticuerpos marcados con fluorocromos, es ventajoso porque permite la marcación y detección simultánea de varios antígenos. Sin embargo, se debe tomar precaución para evitar el fotoblanqueo de los fluorocromos unidos, lo cual suele ser irreversible.

La inmunotinción con oro (marcación con inmunooro) es útil para análisis de alta resolución. Las muestras pueden ser incubadas con anticuerpos que se encuentran unidos a partículas de oro de diferentes tamaños, permitiendo la detección de diferentes antígenos en una misma muestra. Estas partículas pueden ser detectadas con alta sensibilidad y alta resolución en escaneos con microscopio electrónico, permitiendo una localización muy precisa de los antígenos blanco dentro de las células y tejidos. Este tipo de tinción es comúnmente utilizada para verificar la localización subcelular o estructuras específicas derivadas de la célula tales como los exosomas [39].

Métodos IndicacionesVentajas y desventajas
Colorimétrico ligado a enzimaMicroscopía de campo claro estándar
  • Permite la detección de 1 o 2 blancos mediante microscopía de campo claro estándar
  • Relativamente económico
  • Amplia disponibilidad
  • Los epítopes pueden ser dañados por la fijación
  • El fondo puede ser alto
  • Limitado con respecto a la detección de múltiples blancos.
Fluorescente ligado a enzimaMicroscopía fluorescente/confocal
  • Permite la detección de blancos múltiples y métodos como el FRET (dependiendo de la disponibilidad de filtros fluorescentes)
  • Tecnología generalmente disponible
  • Las muestras teñidas son susceptibles al fotoblanqueo irreversible si son utilizadas o almacenadas incorrectamente
Marcado con oroMicroscopía electrónica
  • Permite la detección de 1 o 2 blancos con resolución extremadamente alta
  • Costoso
  • Limitado con respecto a disponibilidad y detección de blancos múltiples.
Tabla 5. Métodos de detección por anticuerpos unidos en inmunohistoquímica e inmunocitoquímica.
Ensayo de ligado por proximidad (del inglés, PLA)

La detección y caracterización de la interacción entre dos proteínas siempre es un reto. Métodos tradicionales tales como el ensayo de dos híbridos son complejos y presentan algunas limitaciones. El ensayo de ligado por proximidad (PLA) es una técnica rápida, sensible y fácil que permite la detección y cuantificación simultánea de interacciones entre proteínas. Mas aún, teniendo un enfoque in situ, es posible determinar la localización celular de la interacción en células adherentes y/o en tejidos congelados o embebidos en parafina. El PLA también permite la detección y cuantificación de una sola proteína en condiciones nativas. El PLA fue descripto por primera vez en el año 2002 por Fredriksson et al. [40]. Desde entonces, esta técnica se ha convertido en una de las mas utilizadas para analizar interacciones en proteínas nativas, bajo condiciones no perturbadas. La metodología del PLA está basada en el uso de dos anticuerpos marcados con oligonucleótidos: estos anticuerpos pueden unirse a dos epítopes diferentes de la misma proteína o de dos proteínas diferentes. Cuando los anticuerpos se encuentran muy próximos (a 20-40 nm de distancia), por ejemplo cuando las dos proteínas analizadas están interaccionando, las sondas de oligonucleótidos en los anticuerpos hibridizarán y se unirán con otros dos "oligos conectores" para formar una estructura de ADN circular continua. En este punto, una polimerasa de ADN amplificará la estructura circular, la cual permanece unida covalentemente a uno de los anticuerpos del PLA. La molécula de ADN amplificada puede ser detectada utilizando métodos estándar de fluorescencia, indicando de esta manera la interacción entre las dos proteínas analizadas. La metodología de PLA ha sido utilizada para una plétora de aplicaciones: una de las mas comunes es la validación de biomarcadores en ambiente clínico [41-43]. El PLA también ha sido utilizado para estudiar el rol de proteínas específicas en procesos biológicos, tales como la progresión del cáncer. Recientemente, el PLA ha sido mejorado para detectar de manera directa modificaciones postraduccionales tales como la acetilación, la fosforilación, etc.

Aplicaciones de anticuerpos Figura 10
Figura 10. Esquema procedimental para el marcado de superficie de células para la clasificación celular asistida por magneto y/o citometría de flujo. Imagen representativa de datos de citometría de flujo muestra células T CD8+ T separadas por MACS marcadas con anticuerpos contra las moléculas de superficie CD44 y CD107a.
Aplicaciones de célula completa in vitro e in vivo
Citometría de flujo - análisis de poblaciones celulares

Uno de los usos mas comunes de los anticuerpos tanto en investigación biomédica como en ensayos clínicos es como medio para determinar el estado de varias poblaciones celulares mediante el marcado superficial y el subsiguiente análisis en un citómetro de flujo. La tinción superficial con anticuerpos marcados con fluorocromos puede ser realizada rápidamente en suspensiones de célula única; está tinción tiende a ser altamente especifica y puede ser detectada con alta sensibilidad. Adicionalmente, dado que muchos citómetros de flujo pueden detectar tres o mas fluorocromos en simultáneo, las células pueden ser marcadas con múltiples anticuerpos, lo que permite la identificación de subgrupos particulares así como de proteínas de superficie cuya expresión se ve incrementada tras la diferenciación celular, activación o apoptosis. Los anticuerpos deben ser elegidos cuidadosamente para asegurar que el epítope del antígeno blanco se expresa en la superficie extracelular de la célula, y un agente bloqueante (por ej. Ig total de la misma que el anticuerpo) debe ser utilizado para impedir la unión no especifica a receptores de Fc que se encuentran presentes en muchos tipos celulares tales como subgrupos de leucocitos (figura 10). Adicionalmente, la tinción con anticuerpo y la citometría de flujo pueden ser utilizadas para detectar proteínas que residen dentro del núcleo, citosol, y endosomas, tales como factores de transcripción y citoquinas. Para esta aplicación de inmunotinción, las células deben ser fijadas y permeabilizadas con una solución de formaldehído y un detergente suave como saponina, el cual perforará las membranas celulares de manera reversible. La tinción de proteínas intracelulares por anticuerpos debe ser realizada en presencia de un agente permeabilizante para facilitar la transferencia de anticuerpos libres hacia dentro y fuera de la célula. La tinción de superficie debe ser realizada previo a la fijación y permeabilización para evitar la desfiguración de epítopes de proteínas de superficie [44].

Anticuerpos agonistas específicos de receptores celulares de superficie son utilizados comúnmente in vitro para activar células inmunes mediante la unión y entrecruzado de los receptores, produciendo de esta manera la activación de las vías de señalización intracelulares. Por ejemplo, las células T pueden ser estimuladas in vitro con una combinación de anticuerpos contra CD3, el cual se encuentra estrechamente asociado con el receptor de célula T (TCR) y debe ser activado para facilitar la señalización por TCR, y CD28, el cual es un receptor, coestimulatorio. Sin embargo un segundo anticuerpo, específico contra la porción Fc de los anticuerpos primarios, debe ser utilizado para entrecruzar de manera completa los receptores e inducir activación celular detectable. Alternativamente, el anticuerpo estimulante puede ser utilizado para recubrir los platos de cultivo previo a la adición de las células (figuras 6 y 9) [45].

Los anticuerpos también pueden ser utilizados para bloquear receptores en la superficie celular o para neutralizar factores solubles in vitro. Por ejemplo, en ensayos de cambio de direccionalidad de células T cooperadoras, las células T son cultivadas en presencia de citoquinas para promover su diferenciación a un subgrupo particular de células T cooperadoras, así como anticuerpos neutralizantes contra citoquinas que puedan antagonizar la diferenciación o promover la diferenciación a un subgrupo funcional diferente [46].

En la literatura de principios de la década del 90, los autores utilizaban el término "tinción inmunofluorescente" para describir la citometría de flujo.

Clasificación y eliminación celular

La clasificación celular asistida por fluorescencia ("Fluorescence-assisted cell sorting", FACS) emplea la unión específica a células de anticuerpos marcados con fluorocromos para clasificar células de a una por vez sobre la base de parámetros fluorescentes predeterminados. Este método es muy rápido y altamente específico, sin embargo, el equipamiento especializado de la citometría de flujo es requerido. Los anticuerpos también pueden ser utilizados para separar o clasificar células mediante su unión a esperas magnéticas en un proceso conocido como clasificación celular asistida por magnetismo (del inglés, MACS). En el MACS, las células son etiquetadas con anticuerpos marcados que son específicos para marcadores de superficie particulares. Las células etiquetadas luego son incubadas con esperas magnéticas muy pequeñas que se unen a la etiqueta. Las células unidas a las esferas pueden ser separadas fácilmente de aquéllas no etiquetadas mediante la aplicación de un magneto fuerte (figura 10) [47, 48].

Aplicaciones in vivo

Los anticuerpos pueden ser administrados in vivo para eliminar poblaciones celulares específicas para realizar análisis funcionales. Por ejemplo, en estudios inmunológicos, subgrupos específicos de linfocitos efectores pueden ser eliminados en ratones para determinar las consecuencias en la respuesta inmune contra antígenos específicos. Similarmente, los anticuerpos pueden ser utilizados in vivo para neutralizar receptores de superficie en células o para unir factores solubles, similar a las aplicaciones in vitro descriptas mas arriba. Para estas aplicaciones, los anticuerpos generalmente son producidos en grandes cantidades a partir de hibridomas para evitar reacciones contra xenoantígenos y son purificados para remover reactivos de cultivo celular y otros potenciales contaminantes [49].

En conclusión, los anticuerpos son herramientas invaluables para la investigación biomédica, gracias a su alta sensibilidad y especificidad, facilidad de producción y flexibilidad en usos de aplicaciones. Los usos establecidos continúan facilitando la investigación, y se esperan nuevos desarrollos en tecnologías de ensayos basados en anticuerpos para expandir aún mas las capacidades analíticas de laboratorios de investigación básicos y traduccionales.

Espectrometría de masas

La espectrometría de masas (EM) es una técnica analítica que mide la relación masa/carga (m/z) de productos iónicos para detectar, identificar y cuantificar moléculas de matrices simples o complejas. Hoy en día, la EM es una herramienta irremplazable en un amplio rango de campos como la proteómica, el descubrimiento de drogas, análisis ambientales, investigaciones biomédicas. El análisis de proteínas, en particular, ha experimentado un rápido desarrollo desde el uso de instrumentos de EM, permitiendo así una caracterización de estas moléculas cada vez mas precisa y profunda. Sin embargo, la EM tiene algunos problemas con que lidiar como la enorme cantidad de datos generada y la presencia de proteínas de gran abundancia que enmascaran la proteína de interés. El último punto ha sido parcialmente superado con los enfoques de EM dirigidos, tales como monitoreo seleccionado/múltiple de reacción (del inglés, MRM/SRM). En otras palabras, la EM tiene algunos problemas con la sensibilidad mientras que produce datos de alta precisión y especificidad. En este marco de trabajo, la combinación de EM con métodos de afinidad basados en anticuerpos es una estrategia en la cual una molécula de interés primero es capturada utilizando un enfoque basado en anticuerpos, y luego es analizada por EM incrementando tanto la especificidad como la sensibilidad. Existen varios enfoques cuantitativos y cualitativos que han sido desarrollados combinando inmunoensayos y EM. Aquéllos utilizados mas comúnmente son reportados brevemente a continuación.

Estándares de isótopos estables y captura por anticuerpos anti péptido

Las técnicas de EM permiten la cuantificación absoluta de una proteína específica en una muestra compleja como el plasma. Esto es logrado utilizando una mezcla de péptidos sintéticos con isótopos pesados (del inglés, "Absolute QUAntification", AQUA). En 2004 Anderson et al. desarrollaron el método de estándares de isótopos estables y captura por anticuerpos anti péptido (del inglés, SISCAPA) en el cual péptidos de interés son enriquecidos utilizando anticuerpos anti péptido inmovilizados en nanocolumnas [50]. El protocolo se compone de cuatro pasos: i) digestión de la muestra de proteína con tripsina; ii) adición de péptidos estándar con isótopos pesados como en AQUA; iii) inmunoenriquecimiento utilizando anticuerpos específicos anti péptido y iv) cuantificación absoluta de péptidos por espectrometría de masas con ionización por electrospray (del inglés, ESI-MS). El SISCAPA se utiliza para varias aplicaciones, por ejemplo para la validación y cuantificación de biomarcadores como el receptor de transferrina humano en suero en pacientes con cáncer de mama [51]. Sin embargo, el mejoramiento de ensayos de EM dirigida enfocó los estudios de inmuno-EM hacia la combinación de SISCAPA y MRM, generando el llamado "inmuno-MRMR".

inmuno-MRM

La espectrometría de masas con monitoreo de múltiples reacciones (del inglés, MRM-MS) es un tipo de EM dirigida cuantitativa con alta especificidad y precisión. Para incrementar la sensibilidad de este ensayo, es posible enriquecer la mezcla de péptidos de interés mediante inmunoafinidad, realizando un inmuno-MRM. Esta técnica es reproducible, se pueden realizar múltiples ensayos en simultáneo y provee alta sensibilidad y especificidad. El principal problema de extender ampliamente el uso de la inmuno-MRM es la falta de anticuerpos validados específicos para esta técnica. Los anticuerpos generalmente son producidos para el mercado clásico de inmunoensayos (por ej. ELISA, Western blot), mientras que para la inmuno-MRM, los anticuerpos deben ser generados contra péptidos cortos, lineales y proteotípicos. Varios estudios han sido destinados a investigar el uso de anticuerpos monoclonales en inmuno-MRM. Claramente estos anticuerpos resultaron preferibles a los policlonales. Desafortunadamente, los anticuerpos monoclonales son costosos y su producción por sistemas de hibridoma lleva mucho tiempo. Recientemente, la factibilidad de generar anticuerpos monoclonales anti antígenos de péptidos trípticos para inmuno-MRM utilizando un enfoque de clonado de células B recombinantes ha sido demostrado [52].

Inmuno-MALDI

El Immuno-MALDI (iMALDI) es similar al enfoque SISCAPA: incluso en este caso, los péptidos son capturados con anticuerpos anti péptido, pero la muestra enriquecida luego es colocada sobre un blanco específico y es analizada mediante EM por desorción/ionización láser asistida por matriz (del inglés, MALDI). Este método ha sido aplicado para diagnosticar diferentes patologías, tales como la hipertensión [53]. Sin embargo, una de las principales limitaciones del iMALDI consiste en la inhabilidad de realizar múltiples ensayos en simultáneo.

Inmunoensayo espectrométrico de masas

En el inmunoensayo espectrométrico de masas (del inglés, MSIA), propuesto en 1995 [54], una muestra proteica es incubada con esferas recubiertas con un anticuerpo específico y luego es eluida. La muestra obtenida puede ser analizada directamente mediante EM MALDI-TOF, siguiendo un enfoque de "arriba hacia abajo" sobre toda la proteína [55]. El método MSIA también puede ser acoplado a un enfoque de EM dirigido como el SRM o MRM, mediante digestión tríptica de la muestra eluida y subsiguiente análisis por EM. Este enfoque puede ser automatizado y se pueden analizar múltiples muestras en simultáneo, como reportado recientemente por Gauthier et al. [56].

Reconocimiento

La Dra. Valeria Severino editó el texto y añadió discusiones sobre el PLA, RIP, CLIP, Inmuno-PCR, SISCAPA, inmuno-MRM, iMALDI, y MSIA el 10 de marzo del 2016.

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