Vida Media de los Anticuerpos/Cómo Almacenar Anticuerpos
Mary Johnson (mary at labome dot com)
Synatom Research, Princeton, New Jersey, United States
Translator
Camila Navas
Bogotá, Columbia
DOI
http://dx.doi.org/10.13070/mm.es.2.120
Date
fecha : 2016-03-06; original version : 2012-10-12
Cite as
MATER METHODS es 2012;2:120
Resumen

Una discusión completa acerca del almacenamiento de anticuerpos y vida media de anticuerpos.

English Abstract

A thorough discussion about antibody storage and antibody shelf life.

La vida media en almacenamiento de los anticuerpos puede variar desde semanas hasta varios años, dependiendo de la naturaleza intrínseca del anticuerpo y las condiciones de almacenamiento. Un número de anticuerpos de diagnóstico han demostrado preservar sus funciones después de 12-26 años en almacenamiento a 4ºC. Las condiciones óptimas de almacenamiento son únicas para cada anticuerpo; sin embargo, existen guías generales que pueden ser aplicadas. Los anticuerpos deben ser almacenados a temperatura y rango de pH apropiado, y frecuentemente, en la presencia de sustancias concentradas (~1 M) como glicerol y sacarosa, esto con el fin de evitar actividad y prevenir la acumulación. En la tabla 1 se resumen las condiciones comunes de almacenamiento y otras características.

Acuoso, 4°C25-50% glicerol o etilenglicol, -20°Ccongelado a -20 - -80°C o en nitrógeno líquidoliofilizado*1
Vida media general1 mes1 añoAñosAños
Concentración de anticuerpos1-5 mg/ml1-5 mg/ml1-5 mg/ml1-5 mg/ml
Proteínas transportadoras para diluciónBSABSABSAno
Estéril o requerimiento antibacterialUsualmenteNoNo
AntioxidantesUsualmente; 2-ME, DTT*2Usualmente; 2-ME, DTT*2NoNo
Conjugación fluorescenteProteger de la luzProteger de la luzProteger de la luzProteger de la luz
Valor de pH7.2-7.67.2-7.6NingunoNinguno
Quelante de metalEDTAEDTANoNo
Usos múltiples de una sola alícuotaNo; ciclos congelamiento/descongelamiento degradan anticuerposNo aplica
Tabla 1. Condición de almacenamiento del anticuerpo. *1 discutido en detalle más adelante. *2 metionina también puede ser considerada.
Condiciones de Almacenamiento
Equipo de Laboratorio
Refrigeradores

Cuando se almacenan anticuerpos en temperaturas bajo cero, es importante NO usar refrigeradores con sistema anti-congelamiento. Los refrigeradores comunes cuentan con este sistema, y realizan ciclos de descongelamiento repetidamente para evitar la formación de escarcha.

Recipientes de almacenamiento

Los anticuerpos conjugados deberían ser almacenados en recipientes oscuros o cubiertos en láminas de aluminio.

Temperatura

Modificaciones químicas tales como la oxidación y la degradación proteolítica de proteínas ocurren a temperaturas moderadas; No obstante, la extensión de estas reacciones es mucho más pronunciada en temperaturas altas. Los anticuerpos están generalmente almacenados a ≤ 4ºC en recipientes de vidrio limpios y estériles o tubos de polipropileno. El almacenaje a temperatura ambiente suele conllevar a la degradación y/o inactividad de los anticuerpos, usualmente generando el desarrollo de microbios. Para almacenamiento en corto plazo (desde un día hasta pocas semanas), las soluciones de anticuerpos de reserva pueden ser almacenadas a 4ºC sin perdida significante de actividad. Bajo almacenamiento extremo como 40ºC en 1 semana con una formulación típica de pH de 6.0, se encontraron modificaciones de residuos de Asp/Asn en accesos Fv hasta en el 39% de las moléculas de anticuerpos [1].

Crioprotectores: Glicerol y Etilenglicol

La formación de cristales de hielo puede destruir la estructura de la proteína, haciendo inefectivos los anticuerpos. Los crioprotectores, tales como el glicerol y etilenglicol previenen la formación de lazos de hidrógeno entre moléculas de agua, reduciendo los puntos de congelación cuando se agrega a una solución acuosa. El punto real de congelación depende de la composición/concentración de los crioprotectores, véase Tabla 2.

102030405060708090100
Glicerol-2-5-10-16-22-34-38-19-217
Etilenglicol-4-7-15-23-34-48-51-45-29-12
Tabla 2. Puntos de congelación (en Celsius) de glicerol y etilenglicol a diferentes concentraciones (en porcentaje%) en agua.

Nota: el etilenglicol es tóxico, y debe ser manejados con el respectivo cuidado.

Cuando la temperatura de almacenamiento de una solución de anticuerpos con crioprotectores está por del bajo del punto de congelación, ésta se solidificará. No obstante, en lugar de cristales de hielo, se podrá formar vitrificación, como ocurre en la criopreservación de células/embriones con DMSO. Durante la vitrificación, se mantiene la estructura integral de los anticuerpos.

Para aumentar la estabilidad, se añaden glicerol o etilenglicol para llegar a una concentración final del 50%; el anticuerpo puede ser almacenado a -20ºC. La solución de anticuerpo debe ser almacenada en pequeñas alícuotas para evitar ciclos anti-congelamiento repetidos.

Es importante utilizar preparaciones de glicerol estéril, debido a que el glicerol puede estar contaminado con microbios.

Esterilización y Compuestos Antimicrobianos

Las preparaciones de anticuerpos siempre deben ser esterilizadas por filtración, utilizando un filtro micrón 0.45 que debe ser manejando asépticamente para prevenir contaminación microbiana.

Agente antimicrobianos como la azida de sodio (NaN3) a una concentración final de 0.02-0.05% (w/v, peso sobre volumen) o timerosal a una concentración final de 0.01%(w/v), inhiben el crecimiento microbiano.

La azida de sodio (NaN3) es tóxica para la mayoría de las células y organismos, y para los humanos (ver figura 1) [2]. Sin embargo, las bacterias gram-positivas (estreptococo, neumococo, lactobacilo) son resistentes a la azida de sodio (ver figura 2) [3-5]. La azida de sodio inhibe la citocromo oxidasa en la cadena de transporte de electrones mitocondriales e induce, por ejemplo, apoptosis en células RGC-5 [6]. Los anticuerpos en solución de azida de sodio NO deben ser usados directamente en células vivas o en estudios in vivo. Conjuntamente, la azida de sodio interfiere con la mayoría de reacciones de conjugación. La azida de sodio puede ser removida mediante filtración de gel o diálisis.

Dato: La azida de sodio fue utilizada en generaciones antiguas de airbag en los automóviles.

Vida Media de los Anticuerpos/Cómo Almacenar Anticuerpos Figura 2
Figura 2. La azida de sodio no logra inhibir el crecimiento de bacterias gram-positivas. Tomado de [3].
Inhibidores de Proteasa

Los inhibidores de proteasa previenen la ruptura proteolítica de proteínas. La proteólisis de anticuerpos puede ser un tema importante para almacenar fluido ascítico y preparaciones de suero, ya que ambas preparaciones contienen proteasa. Almacenamiento frío y/o inhibidores de proteasa pueden ser utilizados para remediar esta degradación.

Concentración de Anticuerpos

Las soluciones de anticuerpo diluidas (< 1 mg/mL) son más propensas a inactivarse y a tener perdidas físicas como resultado de un nivel bajo de vinculación a los recipientes de almacenamiento. Debido a esto, es recomendable mantener la concentración de anticuerpos tan alta como sea posible (por ejemplo, >1 mg/mL. Las proteínas portadoras o de relleno, tales como albumina de suero bovino pura (ABS) o gelatina, pueden ser agregadas para diluir soluciones de anticuerpos hasta una concentración final de proteína de 1-5 mg/mL (0.1-0.5%)

Hielo Seco Durante Almacenamiento y Transporte

Una investigación reciente indica que el hielo seco durante el almacenamiento y transporte de proteínas puede ocasionar la acidificación de la solución almacenada, y ocasionaría acumulación de proteínas (con o sin precipitación), especialmente en proteínas acidas (aquellas proteínas con un pH inferior a 7) [7]. Los IgG policlonales tienden a ser ácidos, con un rango de pH de 4.7-7.5 [8]. Recipientes y/o bolsas plásticas (para los recipientes) selladas con gas deberían ser usadas para minimizar el daño además de re-equilibrar cualquier muestra en congelador a -80ºC por un par de días. Bolsas de las marcas 3M (Dri-Shield con barrera anti-humedad), Thermo ScientificTM, NuncTM, productos crioflex y bolsas IMPAK como 0203PM56OZETN y 05MP081OZE pueden ser de ayuda.

Antioxidantes

El efecto de la oxidación en moléculas de anticuerpos ha sido estudiado extensivamente, especialmente en anticuerpos terapéuticos. Cuando éstos son expuestos a luz y/o a elevadas temperaturas, los residuos de metionina en sus cadenas tienden a ser el primer lugar de oxidación [9]. Los anticuerpos contienen enlaces de desulfuro tanto entre como dentro de las cadenas. Antioxidantes de uso común como 2-ME y DTT pueden no prevenir la reestructuración de desulfuro [10], mientras otro antioxidante --- como la metionina no da lugar a la reestructuración de desulfuro, y puede hacer un mejor trabajo como antioxidante durante el almacenamiento de anticuerpos.

Liofilización

La liofilización es el método preferido para la estabilización de anticuerpos monoclonales en almacenamiento a largo plazo, generalmente inestables en líquido. En comparación a otros métodos, la liofilización seca los anticuerpos a temperaturas bajas, reduciendo el daño a los productos y manteniendo la integridad molecular. Esto extiende su vida media, reduciendo la temperatura requerida para envíos y preservando sus propiedades biológicas y químicas. Los anticuerpos liofilizados son estables durante 3-5 años sin perder actividad, si son almacenados a -20ºC o menos. Generalmente, los anticuerpos deben ser conservados en estado liofilizado y ser reconstituidos antes de su uso (pueden ser reconstituidos agregando agua desionizada o destilada e invertir el contenedor 5-6 veces a temperatura ambiente). El anticuerpo reconstituido puede ser almacenado por varias semanas a 2-8ºC o hasta 1-2 años a -20ºC o menos.

La estabilidad del anticuerpo en estado sólido seco es sensible al pH [11]. Éste juega un papel dominante en la determinación de la estabilidad física del IgG1 en estado liofilizado, siendo el pH 5 el más estable. Hay más agregados y cambios estructurales secundarios/terciaros en pH bajo [11]. Por lo anterior, generalmente se requieren sales amortiguadoras en formulaciones proteínicas para controlar el pH y minimizar la degradación de proteínas durante la liofilización. El contenido húmedo residual es clave para mantener la estabilidad de los anticuerpos. Chang et al. encontró que la estabilidad óptima del anticuerpo IgG1 existe en contenido intermedio de agua (2%-3%) [12]. El contenido de agua más bajo no es necesariamente la condición óptima, y la humedad residual debería ser optimizada durante el desarrollo de la formulación.

Durante la liofilización y con ausencia de estabilizadores, las proteínas son desnaturalizadas, con frecuencia formando estructuras intermoleculares lámina-β. Estabilizadores diferentes tales como azúcares (sacarosa y trehalosa usadas en su mayoría como estabilizadores) o polioles (glicerol y sorbitol) normalmente son agregados a las formulaciones para proteger los anticuerpos monoclonales contra la degradación durante la liofilización y almacenamiento. La presencia de sacarosa en la formulación ayuda a preservar la estructura nativa de la proteína en estado sólido e inhibe la inestabilidad física durante almacenamiento a largo plazo [12]. Mejorías en la estabilidad de la proteína se presentan por la estructura amorfa del manitol, debido a la inhabilidad de éste para cristalizarse durante la liofilización, potencialmente mediante la interacción de enlaces de hidrógeno del poliol con cadenas laterales de proteínas. Azúcares en combinación con polioles son más efectivos juntos que aislados al prevenir agregados, como es evidenciado por las formulaciones de disacáridos/manitol que mantuvieron su estructura nativa mejor que las formulaciones de sólo manitol. La adición de una cantidad pequeña de sorbitol una formulación basada en sacarosa resulta en una retención mayor de la estructura nativa y mejor estabilidad [12].

El nivel de estabilización ofrecido por azúcares o polioles depende generalmente en sus concentraciones. Aumentando la concentración azúcar/poliol a cierto nivel puede alcanzar eventualmente un límite de estabilización o incluso desestabilizar una proteína durante la liofilización, esto quiere decir que un radio molar específico de estabilizador a proteína es requerido para la estabilidad en almacenamiento de un anticuerpo monoclonal liofilizado. Diferentes estudios de estabilidad son realizados utilizando concentraciones iso-osmóticas de azúcares (por ejemplo, 275 mM sacarosa o trehalosa), JEFFREY et al. encontró que un radio molar de 360:1 de azúcar a proteína era suficiente para proveer estabilidad en almacenamiento de rhuMAb HER2, y la concentración de azúcar era 3-4 veces inferior a la concentración iso-osmótica usada típicamente en formulaciones [13]. La cantidad de estabilizadores usados para protección de proteínas durante la liofilización depende en la composición y concentración de la formulación, además de las propiedades físicas del estabilizador y su compatibilidad con la proteína. El almacenamiento a largo plazo para anticuerpos a temperatura ambiente o más alta puede lograrse por liofilización mediante la selección apropiada de radio molar y mezcla de azúcares. El mecanismo de estabilización por azúcares durante el secado, consiste en la producción de una matriz vidriosa para restringir la movilidad (mecanismo de dinámica de vidrio) y/o la actuación como substituto de agua (mecanismo de substitución de agua). Cuando el agua es removida durante el secado, los estabilizadores pueden formar enlaces de hidrógeno con la proteína, como ocurre en las moléculas de agua, así preservando la estructura nativa de la proteína durante el proceso de liofilización.

La liofilización es una buena opción para alcanzar un óptimo almacenamiento a largo plazo de anticuerpos a temperatura ambiente. Sin embargo, los problemas aún existen. Las proteínas pueden volverse inestables durante el proceso de liofilización y/o el almacenamiento a largo plazo. Éste es un método con poca eficiencia, alto consumo de energía y una gran inversión en equipo. No existe un protocolo universal ni simple en la formulación de anticuerpo, y la prueba y error es aún requerida en muchas ocasiones.

Luz

Residuos aromáticos de aminoácidos en proteínas tienen la capacidad de absorber luz ultravioleta, y se demostró que la luz induce la conversión de Trp a gil. y hidroperóxido de gil. en IgG1 [14]. Químicos, como detergentes (por ejemplo, Tween 80), en solución pueden inducir foto-sensibilidad adicional a los anticuerpos [15]. Por lo anterior, no se recomienda la exposición prolongada de anticuerpos a la luz (especialmente a la luz ultravioleta).

Esfuerzo mecánico: centrifugación, agitación y colocación del recipiente

Los anticuerpos, y de hecho proteínas en general, pueden acumularse y degradarse cuando son sujetas a esfuerzos mecánicos durante centrifugación, agitación y colocación del recipiente [16-18]. Esto es como mínimo debido a la cavitación y exposición de proteínas en el aire [18].

Anticuerpos Policlonales

Poca perdida de actividad puede ocurrir cuando el suero es directamente almacenado durante una década a -20ºC. Aún así, una vez un anticuerpo es purificado, se ha presenciado pérdida paulatina de actividad al pasar los años. También, parece que el glicerol puede no ser necesario para el almacenamiento a -20ºC durante años o incluso décadas, si los anticuerpos no experimentan ciclos repetidos de congelamiento/descongelamiento. Los anticuerpos almacenados deben estar en altas concentraciones.

Anticuerpos Monoclonales

Los anticuerpos monoclonales pueden ser almacenados a -20ºC en 50% de glicerol.

También se ha reportado que los anticuerpos monoclonales pueden ser almacenados como gránulos en sulfato amónico a 4ºC o -20ºC durante numerosos años sin presentar pérdida de actividad, crecimiento excesivo de bacterias u oxidación.

La liofilización ofrece una alternativa para estabilizar anticuerpos que no pueden someterse al congelamiento. En la mayoría de las situaciones, las proteínas liofilizadas pueden ser almacenadas a -20ºC. La liofilización requiere equipo costoso y es laboralmente intensiva.

Anticuerpos conjugados

Los anticuerpos conjugados, generalmente, deberían ser almacenados en recipientes oscuros o láminas de aluminio.

Anticuerpos conjugados con enzimas

La fosfatasa alkalina y otras enzimas conjugadas son particularmente sensibles al congelamiento, y deberían, en general, ser almacenadas a 4ºC durante un tiempo corto después de la conjugación.

Los conjugados de los anticuerpos se almacenan mejor a largo plazo a temperaturas de -20ºC con una concentración final del 50% de glicerol y etilenglicol. Aunque algunos conjugados de enzimas pueden ser almacenados a -20ºC sin crioprotectores, las existencias congeladas deben ser alícuotas de único uso para prevenir ciclos repetidos de congelamiento y descongelamiento.

Anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano picante pueden ser almacenados en suero (a 20-30%) de caballo, bovino adulto, ternero, o conejo, o en uno de los muchos estabilizadores comerciales, incluso en una combinación de ambos (Oded Babai, Savyon Diagnostics, Israel).

Anticuerpos conjugados con fluorescencia

La fluorescencia puede foto-aclarar cuando es expuesta a la luz. Como con muchos reactivos conjugados con etiquetas fluorescentes (no solo anticuerpos), los conjugados del anticuerpo deben ser protegidos de la luz. Anticuerpos conjugados con fluoróforo deben ser almacenados a 4ºC y nunca deben ser congelados.

Referencias
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