Vida Media de los Anticuerpos/Cómo Almacenar Anticuerpos
Mary Johnson (han at labome dot com)
Synatom Research, Princeton, New Jersey, United States
Translator
Camila Navas
Bogotá, Columbia
DOI
//dx.doi.org/10.13070/mm.es.2.120
Date
fecha : 2018-05-23; original version : 2012-10-12
Cite as
MATER METHODS es 2012;2:120
Resumen

Un resumen completo acerca del almacenamiento de anticuerpos y la caducidad de los anticuerpos.

English Abstract

A thorough discussion about antibody storage and antibody shelf life.

La caducidad del almacenamiento de los anticuerpos puede variar desde semanas hasta varios años, dependiendo de la naturaleza intrínseca del anticuerpo y las condiciones de almacenamiento. Diversos anticuerpos de diagnóstico han demostrado preservar su funcionalidad tras 12-26 años en almacenamiento a 4ºC. Las condiciones óptimas de almacenamiento son únicas para cada anticuerpo; sin embargo, existen un conjunto de directrices que pueden aplicarse de manera general. Los anticuerpos deben ser almacenados a una temperatura y rango de pH apropiado, y frecuentemente, en presencia de sustancias concentradas (~1 M) como glicerol o sacarosa, esto con el fin de preservar la actividad y prevenir la agregación. En la tabla 1 se resumen las condiciones comunes de almacenamiento y otras características.

Acuoso, 4°C25-50% glicerol o etilenglicol, -20°Ccongelado a -20 - -80°C o en nitrógeno líquidoliofilizado*1
Vida media general1 mes1 añoAñosAños
Concentración de anticuerpos1-5 mg/ml1-5 mg/ml1-5 mg/ml1-5 mg/ml
Proteínas transportadoras para diluciónBSABSABSAno
Esterilidad o requerimiento antibacterianoUsualmenteNoNo
AntioxidantesUsualmente; 2-ME, DTT*2Usualmente; 2-ME, DTT*2NoNo
Conjugación fluorescenteProteger de la luzProteger de la luzProteger de la luzProteger de la luz
Valor de pH7.2-7.67.2-7.6NingunoNinguno
Quelante de metalEDTAEDTANoNo
Usos múltiples de una sola alícuotaNo; ciclos congelamiento/descongelamiento degradan anticuerposNo aplica
Tabla 1. Condición de almacenamiento del anticuerpo. *1 discutido en detalle más adelante. *2 metionina también puede ser considerada.
Condiciones de Almacenamiento
Equipo de Laboratorio
Frigoríficos

Cuando se almacenan anticuerpos en temperaturas bajo cero, es importante NO usar frigoríficos con sistema anti-escarcha (no Frost). Los frigoríficos comunes cuentan con este sistema, y realizan ciclos de descongelamiento repetidamente para evitar la formación de escarcha.

Recipientes de almacenamiento

Los anticuerpos conjugados deberían ser almacenados en recipientes oscuros o cubiertos en láminas de aluminio.

Temperatura

Modificaciones químicas tales como la oxidación y la degradación proteolítica de proteínas ocurren a temperaturas moderadas; no obstante, la magnitud de estas reacciones es mayor a temperaturas altas. Los anticuerpos están generalmente almacenados a ≤ 4ºC en recipientes de vidrio limpios y estériles o tubos de polipropileno. El almacenaje a temperatura ambiente suele conllevar a la degradación y/o inactividad de los anticuerpos, generalmente debido al crecimiento de microbios. Para almacenamiento en corto plazo (desde un día hasta pocas semanas), las soluciones de anticuerpos de reserva pueden ser almacenadas a 4ºC sin una pérdida significativa de actividad. Bajo almacenamiento en condiciones extremas tal como 40ºC durante 1 semana con una formulación típica de pH de 6.0, se detectaron modificaciones de residuos de Asp/Asn de los lugares de acceso de la región Fv hasta en el 39% de las moléculas de anticuerpo [1].

Crioprotectores: Glicerol y Etilenglicol

La formación de cristales de hielo puede destruir la estructura de la proteína, haciendo inefectivos los anticuerpos. Los crioprotectores, tales como el glicerol y etilenglicol previenen la formación de lazos de hidrógeno entre moléculas de agua, reduciendo los puntos de congelación cuando se añaden a una solución acuosa. El punto real de congelación depende de la composición/concentración de los crioprotectores, véase Tabla 2.

102030405060708090100
Glicerol-2-5-10-16-22-34-38-19-217
Etilenglicol-4-7-15-23-34-48-51-45-29-12
Tabla 2. Puntos de congelación (en Celsius) de glicerol y etilenglicol a diferentes concentraciones (en porcentaje%) en agua.

Nota: el etilenglicol es tóxico, y debe ser manejados con el respectivo cuidado.

Cuando la temperatura de almacenamiento de una solución de anticuerpos con crioprotectores está por del bajo del punto de congelación, ésta se solidificará. No obstante, en lugar de cristales de hielo, se podrá formar vitrificación, como ocurre en la criopreservación de células/embriones con DMSO. Durante la vitrificación, se mantiene la estructura integral de los anticuerpos.

Vida Media de los Anticuerpos/Cómo Almacenar Anticuerpos Figura 1
Figura 1. A diferentes concentraciones, la azida de sodio inhibe el crecimiento de bacteria gram-negativa. Tomado de [3].

Cuando la temperatura de almacenamiento de una solución de anticuerpos con crioprotectores está por del bajo del punto de congelación, ésta se solidificará. No obstante, en lugar de cristales de hielo, se podrá formar vitrificación, como ocurre en la criopreservación de células/embriones con DMSO. Durante la vitrificación, se mantiene la estructura integral de los anticuerpos.

Vida Media de los Anticuerpos/Cómo Almacenar Anticuerpos Figura 1
Figura 1. A diferentes concentraciones, la azida de sodio inhibe el crecimiento de bacteria gram-negativa. Tomado de [3].

Para aumentar la estabilidad, se añaden glicerol o etilenglicol para llegar a una concentración final del 50%; el anticuerpo puede ser almacenado a -20ºC. La solución de anticuerpo debe ser almacenada en pequeñas alícuotas para evitar ciclos de descongelamiento repetidos.

Es importante utilizar preparaciones de glicerol estéril, debido a que el glicerol puede estar contaminado con microbios.

Esterilización y Compuestos Antimicrobianos

Las preparaciones de anticuerpos siempre deben ser esterilizadas por filtración, utilizando un filtro de 0.45 um que debe ser manipulado asépticamente para prevenir la contaminación microbiana.

Agentes antimicrobianos como la azida de sodio (NaN3) a una concentración final de 0.02-0.05% (w/v, peso sobre volumen) o timerosal a una concentración final de 0.01%(w/v), inhiben el crecimiento microbiano.

La azida de sodio (NaN3) es tóxica para la mayoría de las células y organismos, y también para los humanos (ver figura 1) [2]. Sin embargo, las bacterias gram-positivas (estreptococo, neumococo, lactobacilo) son resistentes a la azida de sodio (ver figura 2) [3-5]. La azida de sodio inhibe la citocromo oxidasa en la cadena de transporte de electrones mitocondriales e induce, por ejemplo, apoptosis en células RGC-5 [6]. Los anticuerpos en solución de azida de sodio NO deben ser usados directamente en células vivas o en estudios in vivo. Conjuntamente, la azida de sodio interfiere con la mayoría de reacciones de conjugación. La azida de sodio puede ser eliminada mediante filtración de gel o diálisis.

Dato: La azida de sodio fue utilizada en los antiguos modelos de airbag de los automóviles.

Vida Media de los Anticuerpos/Cómo Almacenar Anticuerpos Figura 2
Figura 2. La azida de sodio no logra inhibir el crecimiento de bacterias gram-positivas. Tomado de [3].
Inhibidores de Proteasa

Los inhibidores de proteasa previenen la ruptura proteolítica de proteínas. La proteólisis de los anticuerpos puede ser un problema importante al almacenar fluido ascítico y preparaciones de suero, ya que ambas preparaciones contienen proteasa. Almacenamiento en frío y/o inhibidores de proteasa pueden ser utilizados para prevenir esta degradación.

Concentración de Anticuerpos

Las soluciones de anticuerpo diluidas (< 1 mg/mL) son más propensas a inactivarse y a tener pérdidas físicas como resultado de una leve unión a la superficie de los recipientes de almacenamiento. Debido a esto, es recomendable mantener la concentración de anticuerpos tan alta como sea posible (por ejemplo, >1 mg/mL. Las proteínas portadoras o de relleno, tales como albumina de suero bovino pura (ABS) o gelatina pueden usarse para diluir las soluciones de anticuerpos hasta una concentración final de proteína de 1-5 mg/mL (0.1-0.5%)

Hielo Seco Durante Almacenamiento y Transporte

Una investigación reciente indica que el hielo seco durante el almacenamiento y transporte de proteínas puede ocasionar la acidificación de la solución almacenada, lo que ocasionaría la agregación de las proteínas (con o sin precipitación), especialmente en proteínas acidas (aquellas proteínas con un pH inferior a 7) [7]. Los IgG policlonales tienden a ser ácidos, con un rango de pH de 4.7-7.5 [8]. Recipientes y/o bolsas plásticas (para los recipientes) herméticas deberían ser usadas para minimizar el daño además de re-equilibrar cualquier tipo de muestra en el congelador a -80ºC por un par de días. Bolsas de las marcas 3M (Dri-Shield con barrera anti-humedad), Thermo ScientificTM, NuncTM, productos crioflex y bolsas IMPAK como 0203PM56OZETN y 05MP081OZE pueden ser de utilidad.

Antioxidantes

El efecto de la oxidación en las moléculas de anticuerpos ha sido estudiado extensivamente, especialmente en anticuerpos terapéuticos. Cuando éstos son expuestos a luz y/o a elevadas temperaturas, los residuos de metionina en sus cadenas tienden a ser el primer lugar de oxidación [9]. Los anticuerpos contienen enlaces disulfuro tanto entre como dentro de las cadenas. Antioxidantes de uso común como 2-ME y DTT podrían no evitar la reestructuración de los enlacesdisulfuro [10], mientras que otro antioxidante --- como la metionina no promueve la reestructuración de dichos enlaces, y puede ser un mejor antioxidante durante el almacenamiento de anticuerpos.

Liofilización

La liofilización es el método preferido para la estabilización de anticuerpos monoclonales en almacenamiento a largo plazo, generalmente inestables en líquido. En comparación a otros métodos, la liofilización seca los anticuerpos a bajas temperaturas, minimizando el daño de los productos y manteniendo la integridad molecular. Esto extiende su vida media, reduciendo los requisitos en la temperatura de los envíos y preservando sus propiedades biológicas y químicas. Los anticuerpos liofilizados son estables durante 3-5 años sin perder actividad, si son almacenados a -20ºC o menos. Generalmente, los anticuerpos deben ser conservados en estado liofilizado y ser reconstituidos antes de su uso (pueden ser reconstituidos agregando agua desionizada o destilada e invertiendo el contenedor 5-6 veces a temperatura ambiente). El anticuerpo reconstituido puede ser almacenado durante varias semanas a 2-8ºC o hasta 1-2 años a -20ºC o menos.

La estabilidad del anticuerpo en estado sólido seco es sensible al pH [11]. Éste juega un papel dominante en la determinación de la estabilidad física del IgG1 en estado liofilizado, siendo el pH 5 el más estable. Hay más agregados y cambios estructurales secundarios/terciaros a pH bajo [11]. Por lo anterior, generalmente se requieren sales tamponadoras en formulaciones proteínicas para controlar el pH y minimizar la degradación de las proteínas durante la liofilización. El contenido húmedo residual es clave para mantener la estabilidad de los anticuerpos. Chang et al. encontró que la estabilidad óptima del anticuerpo IgG1 se produce con un contenido intermedio de agua (2%-3%) [12]. El contenido de agua más bajo no es necesariamente la condición óptima, y la humedad residual debería ser optimizada durante el desarrollo de la formulación.

Durante la liofilización en ausencia de estabilizadores, las proteínas son desnaturalizadas, formando con frecuencia estructuras intermoleculares tipo lámina-β. Estabilizadores diferentes tales como azúcares (sacarosa y trehalosa usadas en su mayoría como estabilizadores) o polioles (glicerol y sorbitol) se añaden normalmente a las formulaciones para proteger los anticuerpos monoclonales contra la degradación durante la liofilización y almacenamiento. La presencia de sacarosa en la formulación ayuda a preservar la estructura nativa de la proteína en estado sólido e inhibe la inestabilidad física durante almacenamiento a largo plazo [12]. Una mejora en la estabilidad de la proteína es debida a la estructura amorfa del manitol, y a su incapacidad para cristalizar durante la liofilización, posiblemente debido a la interacción de enlaces de hidrógeno del poliol con cadenas laterales de las proteínas. El uso de azúcares en combinación con polioles es más efectivopara prevenir agregados que el azúcar o el poliol por separado, como se demuestra por las formulaciones de disacáridos/manitol que mantuvieron su estructura nativa mejor que las formulaciones de sólo manitol. La adición de una pequeña cantidad de sorbitol a una formulación basada en sacarosa resulta en una mayor retención de la estructura nativa y una mejor estabilidad [12].

El nivel de estabilización que ofrecen los azúcares o polioles depende generalmente de sus concentraciones. Si se aumenta la concentración de azúcar/poliol hasta cierto nivel se puede llegar a alcanzar un límite de estabilización o incluso desestabilizar la proteína durante la liofilización, por lo que un radio molar específico de estabilizador y proteína es necesario para la estabilidad durante el almacenamiento de un anticuerpo monoclonal liofilizado. Diferentes estudios de estabilidad son realizados utilizando concentraciones iso-osmóticas de azúcares (por ejemplo, 275 mM sacarosa o trehalosa), JEFFREY et al. encontró que un radio molar de 360:1 de azúcar/proteína era suficiente para proveer estabilidad en almacenamiento de rhuMAb HER2, y la concentración de azúcar era 3-4 veces inferior a la concentración iso-osmótica usada típicamente en formulaciones [13]. La cantidad de estabilizadores usados para la protección de proteínas durante la liofilización depende en la composición y concentración de la formulación, además de las propiedades físicas del estabilizador y su compatibilidad con la proteína. El almacenamiento a largo plazo de anticuerpos a temperatura ambiente o superior puede lograrse mediante liofilización con una selección apropiada de ratio molar y mezcla de azúcares. El mecanismo de estabilización por azúcares durante el secado, consiste en la producción de una matriz vidriosa que restringe la movilidad (mecanismo de dinámica de vidrio) y/o en la actuación como sustituto de agua (mecanismo de substitución de agua). La mayoría de estudios apoyan este segundo mecanismo. La interacción entre el agua y las proteínas es crucial para la estabilidad conformacional de las proteínas. Cuando se elimina el agua durante el secado, los estabilizadores pueden formar enlaces de hidrógeno con la proteína, como ocurre en las moléculas de agua, así preservando la estructura nativa de la proteína durante el proceso de liofilización.

La liofilización es una buena opción para alcanzar un óptimo almacenamiento a largo plazo de anticuerpos a temperatura ambiente. Sin embargo, los problemas aún existen. Las proteínas pueden volverse inestables durante el proceso de liofilización y/o el almacenamiento a largo plazo. La liofilización es un método con poca eficiencia, alto consumo de energía y requiere una gran inversión en el equipo. No existe un protocolo universal ni simple en la formulación de anticuerpo, y se necesita de la prueba y error en muchas ocasiones.

Luz

Los residuos aromáticos de los aminoácidos en las proteínas tienen la capacidad de absorber luz ultravioleta, y se demostró que la luz induce la conversión de Trp a Gly y hidroperóxido de Gly. en IgG1 [14]. Compuestos químicos como detergentes (por ejemplo, Tween 80), en solución pueden inducir foto-sensibilidad adicional a los anticuerpos [15]. Por lo anterior, no se recomienda la exposición prolongada de anticuerpos a la luz (especialmente a la luz ultravioleta).

Esfuerzo mecánico: centrifugación, agitación y colocación del recipiente

Los anticuerpos, y de hecho las proteínas en general, pueden agregar y degradarse cuando son sujetas a estrés mecánico producidos durante la centrifugación, agitación y colocación en un recipiente [16-18]. Esto es, al menos parcialmente, debido a la cavitación y exposición de las proteínas en el aire [18].

Anticuerpos Policlonales

Muy poca perdida de actividad puede ocurrir cuando el suero es directamente almacenado a -20ºC durante una década. Aun así, una vez se purifica el anticuerpo , se observa una pérdida paulatina de actividad con el paso de los años. También parece que el glicerol puede no ser necesario para el almacenamiento a -20ºC durante años o incluso décadas si los anticuerpos no experimentan ciclos repetidos de congelamiento/descongelamiento. Los anticuerpos almacenados deben estar en altas concentraciones.

Anticuerpos Monoclonales

Los anticuerpos monoclonales pueden ser almacenados a -20ºC en 50% de glicerol.

También se ha descrito que los anticuerpos monoclonales pueden ser almacenados en forma de precipitado en sulfato amónico saturado a 4ºC o -20ºC durante varios años sin presentar pérdida de actividad, crecimiento de bacterias u oxidación.

La liofilización ofrece una alternativa para estabilizar anticuerpos que no pueden someterse al congelamiento. En la mayoría de las situaciones, las proteínas liofilizadas pueden ser almacenadas a -20ºC. La liofilización requiere un equipo costoso y mucho trabajo.

Anticuerpos conjugados

Los anticuerpos conjugados, generalmente, deberían ser almacenados en recipientes oscuros o láminas de aluminio.

Anticuerpos conjugados con enzimas

La fosfatasa alcalina y otras enzimas conjugadas son particularmente sensibles al congelamiento, y deberían, en general, ser almacenadas a 4ºC durante un tiempo corto después de la conjugación.

Los conjugados de los anticuerpos se almacenan mejor a largo plazo a temperaturas de -20ºC con una concentración final del 50% de glicerol y etilenglicol. Aunque algunos conjugados de enzimas pueden ser almacenados a -20ºC sin crioprotectores, las existencias congeladas deben ser alícuotas de único uso para prevenir ciclos repetidos de congelamiento y descongelamiento.

Anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano picante pueden ser almacenados en suero de caballo, bovino adulto, ternero, o conejo al 20-30%, o en uno de los muchos estabilizadores comerciales, incluso en una combinación de ambos (Oded Babai, Savyon Diagnostics, Israel).

Anticuerpos conjugados con fluorescencia

La fluorescencia puede foto-aclarar cuando es expuesta a la luz. Como con muchos reactivos conjugados con etiquetas fluorescentes (no solo anticuerpos), los conjugados del anticuerpo deben ser protegidos de la luz. Anticuerpos conjugados con fluoróforo deben ser almacenados a 4ºC y nunca deben ser congelados.

Referencias
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ISSN : 2329-5139