Estructura y fragmentos de anticuerpos
Mary Johnson (han at labome dot com)
Synatom Research, Princeton, New Jersey, United States
Translator
Agustin Carbajal (quiocarbajal at gmail dot com)
Cordoba, Argentina
DOI
//dx.doi.org/10.13070/mm.es.3.160
Date
fecha : 2016-10-29; original version : 2013-12-21
Cite as
MATER METHODS es 2013;3:160
Resumen

Una descripción en profundidad sobre la estructura y fragmentos varios de los anticuerpos, así como de sus principales aplicaciones.

English Abstract

An in-depth description of antibody structure and various fragments, as well as their major applications.

Anticuerpos convencionales

Los anticuerpos convencionales o de tamaño completo son glicoproteínas llamadas inmunoglobulinas que son producidas por las células plasmáticas en respuesta a moléculas foráneas (inmunógenos). La función principal de los anticuerpos es unirse específicamente a un antígeno y provocar una respuesta inmune, y de esa manera proteger al huésped de la infección. Existen varias clases de anticuerpos, pero este resumen se enfoca en los anticuerpos IgG e IgM, los cuales son ampliamente utilizados en numerosas de aplicaciones en investigación, diagnóstico y terapéutica biomédica.

Estructura del anticuerpo convencional

La unidad básica de un anticuerpo completo es un cuádruple polipéptido conteniendo dos cadenas pesadas y dos livianas unidas por puentes disulfuro. La forma básica de un anticuerpo es la de la letra "Y", y la bisagra en el punto de la estructura "Y" posee flexibilidad. Cada cadena polipeptídica posee una región constante, la cual es muy similar para todos los anticuerpos, y una región variable, la cual es específica para cada anticuerpo en particular. La notación común para la región variable de la cadena liviana es "VL" (del inglés, "Variable Light") y para la región constante de la cadena liviana es "CL" (figura 1, panel izquierdo; del inglés "Constant Light"). La notación es similar para las regiones variables (VH, "Variable Heavy") y constante (CH, "Constant Heavy") de la cadena pesada. Los carbohidratos normalmente se encuentran unidos al dominio CH2 de las cadenas pesadas. La región del fragmento cristalizable (Fc) sólo contiene regiones constantes de las cadenas pesadas (CH), pero la del fragmento de la región de unión al antígeno (Fab) incluye tanto un dominio constante como los dominios variables de las cadenas pesadas y livianas (VH y CL). El fragmento región variable Fv solamente contiene los dos dominios variables (figura 1). Ver anticuerpo de ratón para una discusión sobre isotipos de inmunoglobulinas, subclases y el número de dominios de inmunoglobulinas.

Estructura y fragmentos de anticuerpos Figura 1
Figura 1. La estructura básica de un anticuerpo convencional de tamaño completo (panel izquierdo) y de los fragmentos de anticuerpo comunes (panel derecho). De [51]

Una base de datos de todas las estructuras de anticuerpos públicamente disponibles, la base de datos estructurales de anticuerpos (SAbDab, “Structural Antibody Database”) generada a partir del banco de datos PDB, se encuentra disponible [1].

Aplicaciones de anticuerpos convencionales

Los anticuerpos convencionales han sido utilizados en la investigación para la detección de proteínas por Western blot [2], inmunohistoquímica [3] y ensayos de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) [4] por décadas. Anticuerpos de tamaño completo también han sido desarrollados para aplicaciones de diagnóstico tales como las pruebas de embarazo y la detección de bacterias y virus en sangre, tal como un ELISA para detectar el VIH. Además, los anticuerpos convencionales de tamaño completo son utilizados comúnmente en la terapéutica de enfermedades. Por ejemplo, Infliximab es uno de los muchos anticuerpos disponibles que reconocen el factor alfa de necrosis tumoral (del iglés, TNFα) y es utilizado en el tratamiento de la enfermedad de Crohn y la artritis reumatoidea [5, 6]. Trastuzumab, o Herceptin, es un anticuerpo utilizado en el tratamiento del cáncer de mama metastásico que une al receptor del factor de crecimiento epidermal 2 [7]. Además, existen varias terapias basadas en anticuerpo dadas a receptores de transplantes para prevenir el rechazo al injerto, incluyendo Muromomab [8].

Las ventajas de utilizar anticuerpos convencionales incluyen el hecho de que la región Fc desencadena la respuesta inmune del cuerpo, determinando la destrucción de las moléculas unidas. Las desventajas de anticuerpos de tamaño completo incluyen su inhabilidad para penetrar en ciertos tejidos debido a su tamaño relativamente grande [9]. Una desventaja de utilizar anticuerpos de tamaño completo en aplicaciones clínicas es que el dominio Fc frecuentemente provocará una respuesta inmune, lo que puede ser perjudicial para la salud del paciente. El dominio Fc frecuentemente provoca una unión no especifica significativa, lo cual puede interferir en aplicaciones de detección.

Fragmentos de anticuerpos

Los fragmentos de un anticuerpo pueden ser producidos mediante mecanismos químicos o genéticos. La fragmentación química utiliza agentes reductores para romper los puentes disulfuro de la región bisagra y la digestión del anticuerpo con proteasas incluyendo pepsina, papaína y ficina. La construcción genética de fragmentos ofrece la habilidad de crear numerosas moléculas conteniendo fragmentos, cada una con características de unión y función únicas.

Fab, Fab', (Fab')2, y Fv

La digestión química y por proteasas de anticuerpos de tamaño completo produce fragmentos de unión al antígeno (Fab), los cuales son generados a partir de la región variable de los anticuerpos clase IgG e IgM (figura 1, panel derecho). Los fragmentos Fc, compuestos solo por las regiones constantes de la cadena pesada, son removidos de los Fab. Los fragmentos de unión al antígeno incluyen Fab, Fab', (Fab')2, y Fv. Estos fragmentos son capaces de unir al antígeno pero todos carecen de la región Fc que contiene los dominios constantes 2 y 3 de la cadena pesada. Dos fragmentos F(ab) individuales son separados de la región Fc cuando un anticuerpo de tamaño completo es digerido con la enzima papaína. Sin embargo, un fragmento F(ab')2, el cual retiene una pequeña parte de la región bisagra del Fc, es separado del resto de la región Fc de un anticuerpo mediante digestión con pepsina. Si bien la utilización de métodos bioquímicos para generar fragmentos de anticuerpos produce herramientas útiles para aplicaciones de diagnóstico y terapéutica, resulta muy laborioso y requiere de grandes cantidades de anticuerpo en material de partida.

Fragmentos monovalentes F(ab) poseen un solo sitio de unión a antígeno, mientras que los fragmentos divalentes F(ab')2 poseen dos regiones de unión a antígeno unidas por puentes disulfuro. La reducción de los fragmentos F(ab')2 produce dos fragmentos monovalentes Fab', los cuales poseen un grupo sulfhidrilo libre el cual es útil para la conjugación con otras moléculas.

Los fragmentos Fv son los fragmentos mas pequeños conseguidos por digestión enzimática de anticuerpos clase IgG e IgM. Los fragmentos Fv poseen el sitio de unión a antígeno compuesto por las regiones VH y VC, pero carecen de las regiones CH1 y CL (figura 1, panel derecho). Las cadenas VH y VL se mantienen unidas en los fragmentos Fv mediante interacciones no covalentes.

ScFv, diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo, Bis-scFv, minicuerpo, Fab2, Fab3

Los métodos de ingeniería genética permiten la producción de fragmentos variables de cadena única (ScFv), los cuales son fragmentos tipo Fv que incluyen los dominios VH y VL unidos por un péptido flexible (figura 1, panel derecho) [10]. Cuando el conector es de al menos 12 residuos de largo, los fragmentos ScFv son principalmente monoméricos [11]. La manipulación de la orientación de los dominios V y el largo del conector crean diferentes formas de moléculas Fv [11]. Conectores de 3-11 residuos de largo dan moléculas ScFv incapaces de plegarse para formar un dominio Fv funcional. Estas moléculas se asocian con una segunda molécula ScFv, lo que crea un diacuerpo divalente [12]. Si el conector pose menos de tres residuos, las moléculas ScFv se asocian en triacuerpos o tetracuerpos. Los ScFv multivalentes poseen una mayor afinidad de unión funcional a sus antígenos blanco que sus contrapartes monovalentes al unirse a dos o mas antígenos blanco, lo que reduce la tasa de desprendimiento del fragmento de anticuerpo [13]. Los minicuerpos son proteínas de fusión entre los fragmentos ScFv y CH3 que se ensamblan en dímeros bivalentes. Los fragmentos bis-ScFv son biespecíficos [14]. Los fragmentos ScFv miniaturizados pueden ser generados para poseer dos dominios variables diferentes, permitiendo a estas moléculas Bis-scFv unirse a dos epítopes diferentes al mismo tiempo. Los métodos genéticos también son utilizados para crear dímeros Fab biespecíficos (Fab2) y trímeros Fab triespecíficos (Fab3). Estos fragmentos de anticuerpo son capaces de unir a 2 (Fab2) o 3 (Fab3) antígenos diferentes en simultáneo.

Anticuerpos de camélidos y nanocuerpos

Además de los anticuerpos convencionales, los camélidos poseen un subgrupo de anticuerpos de cadena pesada (hcAb) peculiares compuestos exclusivamente por homodímeros de cadena pesada, faltando las cadenas livianas [15]. La porción Fab de estos anticuerpos es llamada VHH ("variable domain of heavy chain antibodies", dominio variable de anticuerpos de cadena pesada), siendo la región de unión a antígeno mas pequeña que se encuentra en la naturaleza [16]. Los nanocuerpos son dominios recombinantes derivados de VHH capaces de unir antígenos. Son muy estables y pueden ser producidos fácilmente en enormes cantidades utilizando sistemas tradicionales tales como las bacterias, representando, por ende, una herramienta prometedora para la investigación y la terapéutica. Los nanocuerpos también pueden ser expresados directamente in vivo y reconocer sus blancos in vivo. Por ejemplo, el nanocuerpo anti GFP es utilizado para desarrollar un sistema electromagnético de control de actividad neuronal in vivo [17].

CDR3H ultra largo de vaca

Alrededor de un 10 % de las inmunoglobulinas vacunas contienen una región CDR3H larga con múltiples residuos de cisteína [18, 19], se cree que este tallo largo contribuye a la diversidad de anticuerpos [20].

Aplicaciones de fragmentos de anticuerpos

Los fragmentos ofrecen ventajas sobre los anticuerpos de tamaño completo en algunas aplicaciones. Este tópico fue revisado recientemente por Nelson [21]. Una ventaja de los fragmentos por sobre los anticuerpos de tamaño completo es que los fragmentos son lo suficientemente pequeños como para infiltrarse en algunos tejidos en los cuales los anticuerpos de tamaño completo no pueden penetrar, lo cual ayuda tanto en procedimientos terapéuticos como inmunohistoquímicos [9]. Los fragmentos de anticuerpos son mas pequeños que los anticuerpos convencionales y generalmente carecen de glicosilación, permitiendo su producción en sistemas de expresión procariotas, lo cual permite ahorrar tiempo y costos. Sin embargo, los fragmentos que carecen del dominio Fc son degradados en el cuerpo mucho mas rápido que los anticuerpos convencionales [22], y son incapaces de desencadenar los procesos citotóxicos mediados por los Fc a menos que sean conjugados a una fracción efectora [23], lo cual requiere de una mayor optimización para una terapéutica basada en fragmentos de anticuerpo. Sin embargo, la falta del dominio Fc es una ventaja sustancial para anticuerpos primarios utilizados en inmunohistoquímica y otras aplicaciones de detección ya que poseen una unión no especifica al receptor Fc considerablemente menor. Los fragmentos de anticuerpos que no poseen la región Fc tienen la ventaja de una unión no especifica reducida. Un ScFv utilizado comúnmente para diagnóstico es el anticuerpo NC10 contra la neuraminidasa de influenza. El anticuerpo MOC-31 contra la molécula de adhesión celular epitelial, Ep-CAM, es un ScFv utilizado comúnmente en la terapia contra el cáncer. Los diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos poseen usos potenciales en aplicaciones tales como la radioinmunoterapia y diagnósticos por imagen in vivo [24]. Los nanocuerpos pueden ser utilizados para propósitos específicos en (co)-inmunoprecipitaciones, o acoplados a proteínas fluorescentes para rastrear blancos intracelulares en tiempo real en células vivas [25].

Si bien diversos fragmentos de anticuerpo ofrecen ciertas ventajas, no son comúnmente utilizados en experimentos. En los 38430 artículos revisados por Labome hasta marzo del 2016, solo algunos artículos citaron aplicaciones de fragmentos de anticuerpo Fab. Los fragmentos Fab anti digoxigenina de Roche fueron utilizados 1:1.000 o 1:2.000 para realizar hibridizaciones in situ para demostrar que las principales subdivisiones de las extremidades próximodistales dependen de señales que difunden [26], que la ciliogénesis es regulada por un módulo regulatorio en cis ensamblado evolutivamente [27], y que la evolución del patrón mimético del ala de la mariposa podría ser regulado por un gen óptico [28]. También fueron utilizados para realizar análisis de plegado proteico para estudiar el proceso de plegado de una molécula de calmodulina mediante espectroscopia de fuerza de molécula única [29]. El anticuerpo anti digoxigenina de Roche (número de catálogo 11093274910) fue generado en oveja y producido mediante digestión con papaína. Los fragmentos Fab anti fluoresceína conjugados a fosfatasa alcalina de Roche fueron utilizados para realizar Southern blot para estudiar la función de la topoisomerasa II [30]. Ejemplos mas recientes de los reactivos Fab anti dogoxigenina o anti fluoresceína de Roche incluyen estudios para describir el patrón de expresión de connexina 35b expresada neuronalmente [31], para discutir métodos para la investigación de la muerte celular apoptótica en embriones de Drosophila, ovario y líneas celulares cultivadas [32], para evaluar si las concentraciones de GluA2 son reguladas por el tráfico de proteínas o por su traducción local [33], para estudiar la relación entre la formación cortical humana y la interferencia de la señalización mediada por hedgehog [34], para investigar el mecanismo subyacente a las ondas viajeras de la expresión de genes del reloj durante el desarrollo [35], para investigar cómo la interacción entre TRF2 y lamina A/C regula la estructura cromatínica [36], para describir un método para examinar las vías del desarrollo que unen distintos subtipos de neuronas en ratones [37], entre otros [38-48].

El fragmento Fab contra IgG de conejo producido en mono conjugado a Alexa 546 de Invitrogen fue utilizado para realizar experimentos de inmunohistoquímica para investigar el rol de sFLT-1 en el mantenimiento de la capa fotoreceptora avascular en ratones modelo [49] y el fragmento (Fab')2 del anticuerpo anti IgG de cabra (H+L) producido en conejo conjugado a Alexa Fluor 488 de Invitrogen fue utilizado para investigar el mecanismo de regeneración de las “uniones de punta” (tip links) en las células pilosas auditivas [50].

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