Siemens ha desarrollado un método completamente automatizado para la purificación del ácido nucleico que da sustento al análisis de diagnóstico clínico de rutina en el laboratorio de patología molecular así como para allanar el camino para los estudios de los biomarcadores retrospectivos extensivos de los materiales de tejidos fijados en formol y embebidos en parafina con datos de control clínico a largo plazo.
Las características clave de este sistema de extracción directa totalmente automatizado son las siguientes:
- Tecnología única de partículas magnéticas (tamaño de grano < 1 μm) cubierto con una nanocapa de sílice.
- Alto rendimiento de más de 48 muestras de TEP en menos de 4 horas
- Co-extracción de ADN y ARN de una de las muestras de TEP (con el paso de digestión de desoxirribonucleasa I automatizada)
- Deparafinización totalmente integrada por la adsorción hidrofobica (xileno ny/pasos etanol)
Generalmente, la identificación y la validación de los libradores de moléculas en los tejidos fijados en formol y embebidos en parafina (TEP) es un área de intensa y excitante actividad de investigación. Esto se debe en parte al hecho de que se ha demostrado que la expresión de perfilado, la genotipificación y el análisis de mutación ayudan en el diagnóstico y para proporcionar ayuda, particularmente en el tratamiento del cáncer. Hasta la fecha, más allá de este esfuerzo concentrado, se han introducido en la práctica médica de rutina (ej.: OncotypeDX®; análisis de mutaciones k-RAS para terapias dirigidas con base en EGFR) sólo un número limitado de liberadores individuales o paneles de liberadores utilizando ácidos nucleicos extraídos de las muestras de tejidos histopatológicos. El tejido TEP es una herramienta de valor incalculable en la investigación translacional del ADN, ARN y del microARN basada en biomarcadores porque el tejido TEP se encuentra fácilmente disponible mediante el diagnóstico clínico de rutina. Tanto las instalaciones de logística como el fácil acceso a los grandes archivos del tejido TEP proveniente de varias enfermedades relacionadas con las bases de datos clínicas y de seguimiento hacen que este material sea particularmente atractivo.
La expresión proteica en las muestras patológicas por medio de la detección inmunohistoquímica se encuentra bien establecida y actualmente forma parte de la rutina de diagnóstico. Por su parte, los análisis que utilizan el ADN y, en particular, el mARN extraído del tejido TEP se mantienen dificultosos porque el proceso de fijación introduce enlaces entre las proteínas y los ácidos nucleicos. Los enlaces modifican químicamente numerosas moléculas y fragmenta los ácidos nucleicos. Además, muchos métodos para la extracción de ácido nucleico proveniente del tejido TEP, particularmente esos que son altamente manuales, no son protocolos estandarizados (ej.: incluyen tiempos de lisis variables y diferentes composiciones químicas para la extracción de ARN y ADN). Además, estos protocolos manuales demandan mucho tiempo y requieren del uso de materiales peligrosos e inflamables como el xileno y el etanol para la deparafinización. Dichos factores han requerido de una adaptación individualizada para crear los protocolos estándar. Como resultado, estos protocolos de aislamiento han sido compatibles con formatos de alta capacidad.
Las dificultades provenientes del aislamiento de ácidos nucleicos provenientes de las muestras de tejido TEP han sido afrontadas por parte de Siemens con el desarrollo de un método completamente automatizado para su utilización en la patología molecular y el las pruebas de diagnóstico complementarias tanto en las aplicaciones de diagnóstico clínico como para la utilización en la investigación. Los orígenes de esta tecnología son las partículas paramagnéticas recubiertas con sílice de prueba (PMP) desarrolladas por Siemens. Estas PMPs, que se producen por la aplicación de un proceso de fabricación robusto y simple, simplifican y mejoran el aislamiento del ácido nucleico automatizado por medio de las propiedades de las partículas, en especial la nanocapa de sílice adsorbida en las partículas. La Figura 1 muestra una comparación de las PMPs de Siemens con otras esferas que se encuentra comercialmente disponibles. Los ácidos nucleicos se encuentran selectivamente ligados bajo condiciones caotrópicas (selección positiva). Sin embargo, “los desechos o restos de tejido” se encuentran ligados bajo condiciones no-caotróficas excluyendo los destinatarios (selección negativa; ver más abajo). El comportamiento de suspensión óptimo de las partículas se debe a su pequeño tamaño, la distribución homogénea por tamaño de las partículas y las fuertes propiedades de magnetización. Se ha desarrollado una química universal de extracción que abarca los pasos de lisis, lavado y elución para extraer de manera eficiente tanto el ADN como el ARN simultáneamente con alta recuperación y pureza a partir de un amplio rango de tipos de muestras (que se muestra en la Figura 2).
Una de las ventajas principales de la extracción de tejido TEP de Siemens es el flujo que proporciona para la completa integración del paso de deparafinización en el procedimiento de extracción para un proceso que es completamente automático. El paso de deparafinización funciona por medio de una simple y eficiente adsorción hidrofóbica de la parafina derretida hacia la pared interior del tubo de polipropileno del tubo de muestra durante el proceso de la lisis. Este paso no solo reemplaza a los peligrosos y laboriosos pasos del proceso del xileno/etanol sino que también elimina la necesidad de centrifugación. De este modo, el proceso de Siemens es más abordable para la automatización completa. También permite la carga de las secciones de TEP inmediatamente después del corte microtómico.
Con muestras de TEP “sólidas”, resulta difícil estandarizar la entrada porque la condición celular/matriz, la fijación y el almacenamiento pueden ser completamente diferentes. Como resultado, muchos otros métodos requieren de distintos tiempos de incubación para lograr una lisis completa. tra característica clave de la tecnología de Siemens es la habilidad de los TEPs, en la ausencia de sales caotróficas, para ligar o eliminar cualquier tejido sin digerir (restos) (que se los conoce como selección negativa). Dicha selección negativa es un requisito clave para la automatización efectiva y completa ya que cualquier material insoluble puede intervenir con el manejo de líquido preciso y resultar en el atascamiento de la punta de la pipeta.
La plataforma de Siemens utiliza hardware especializado que proporciona las secciones TEP para la carga y la lisis en tubos plásticos de 1,5 ml. que son cargados directamente en el sistema. El sistema permite un rendimiento de más de 48 muestras en menos de 4 horas incluyendo el paso de incubación de 30 minutos para la digestión de la desoxirribonucleasa I para el aislamiento del ARN purificado (con al menos 8 muestras procesadas en 3 horas y 15 minutos). Si el ADN es el resultado deseado, el tiempo total para el procesamiento de 48 muestras se reduce a 2 horas y 40 minutos porque no resulta necesario el paso de la desoxirribonucleasa I. La química de extracción universal permite el aislamiento tanto del ADN como del ARN a partir de la misma muestra. Una consulta de software simple aplica el paso de digestión automatizada de la desoxirribonucleasa I para el análisis de expresión exacto. Para las aplicaciones típicas de ADN, como la mutación y el análisis de polimorfismo por medio de la secuencia clásica ultra profunda, se puede aplicar el ácido nucleico total que contiene eluato.
La extracción totalmente automatizada puede procesar varios ejemplos de formatos de entrada incluyendo las secciones TEP, tejidos pequeños como las muestras de Micromatriz de Tejido (MMT) y secciones fijas de las biopsias con aguja. Incluso las células microdisecadas capturadas por láser, tejido fresco congelado y células de cultivo pueden utilizarse para la extracción.
Además de las ventajas del flujo de la automatización completa un alto rendimiento, el método también recupera altas cantidades de ADN y de ARN con una pureza excelente. Se ha demostrado que el nivel exitoso para extraer ADN o ARN con PCR detectable de miles de muestras de TEP de más de 30 años de edad es de aproximadamente >99% (ref 1,2,3,4). Un eluato estándar de 100 μl normalmente permite llevar a cabo cientos de reacciones de PCR de una sección del tejido.
En términos generales podría decirse que el método de extracción de ácido nucleico totalmente automatizado de Siemens proporciona un número de ventajas cuando se lo compara con los métodos de vanguardia de otros fabricantes. Las ventajas claves incluyen la complete automatización, incluido un paso de deparafinización libre de xileno, un alto rendimiento de las muestras de más de 48 muestras en menos de 4 horas, un química de extracción universal y consolidada para el co-islamiento del ADN y del ARN, un tiempo de lisis estandarizado de una hora, un paso de selección/fijación negativa eludiendo la centrifugación, la entrada de muestras flexibles con respecto al tipo de tejido y al formato, la reproductibilidad superior de sección a sección, reducción de los riesgos continuos y de la compatibilidad con las tecnologías de ensayo subsiguientes como el PCR (RT-) cinético, el punto final de PCR, el secuenciamiento y las micromatrices. El método de purificación del ácido nucleico de Siemens abre camino a los estudios de biomarcadores retrospectivos del material archivado de TEP con datos de seguimiento clínico a largo plazo. Además y más importante es que sustenta el análisis de rutina de este material en el laboratorio de patología molecular o clínica.
Contactos:
- guido.hennig@siemens.com
- ellen.sampson@siemens.com
Figura
REFERENCIAS:
- Kerstin Bohmann, Guido Hennig, Uwe Rogel, Christopher Poremba, Berit Maria Mueller, Peter Fritz, Stephan Stoerkel and Karl-L. Schaefer. ARN Extraction from Archival FFPE Tissue: A Comparison of Manual, Semi-automated and Fully Automated Purification Methods. Clinical Chemistry, 2009; 55:9; 1719-1727
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- Berit Maria Muller, Ralf Kronenwett, Guido Hennig, Heike Euting, Karsten Weber, Kerstin Bohmann, Wilko Weichert, Klaus-Jurgen Winzer, Glen Kristiansen, Christoph Petry, Manfred Dietel, Carsten Denkert. Quantitative determination of estrogen receptor, progesterone receptor and HER2 in formalin-fixed paraffin-embedded tissue - a new option for predictive biomarker assessment in breast cancer. Diagnostic Molecular Pathology 2010 in press
- G. Hennig, M. Gehrmannn, U. Stropp, H. Brauch, P. Fritz, M. Eichelbaum, M. Schwab, W. Schroth. Automated extraction of ADN and ARN from a single formalin-fixed paraffin-embedded tissue section for analysis of both single-nucleotide polymorphisms and mARN expression. Clinical Chemistry, 2010; 56:12; 1845-1853