Detergentes: Triton X-100, Tween-20, y más
Mary Johnson (mary at labome dot com)
Synatom Research, Princeton, New Jersey, United States
Translator
Agustin Carbajal (quiocarbajal at gmail dot com)
Cordoba, Argentina
DOI
http://dx.doi.org/10.13070/mm.es.3.163
Date
fecha : 2016-09-02; original version : 2013-01-18
Cite as
MATER METHODS es 2013;3:163
Resumen

Revisión exhaustiva sobre detergentes de laboratorio y su uso en experimentos biomédicos, con revisión bibliográfica de Labome incluida.

English Abstract

A comprehensive review of laboratory detergents, and their applications in biomedical experiments, including Labome survey results.

Los detergentes utilizados en los laboratorios biomédicos son surfactantes (= que actúan sobre la superficie) intermedios, usados para romper las membranas celulares (lisis celular) y liberar el contenido intracelular solubilizado. Los detergentes rompen las interacciones entre proteínas, entre proteínas y lípidos, y entre lípidos, desnaturalizan proteínas y otras macromoléculas, previenen la unión inespecífica en ensayos inmunoquímicos y en la cristalización de proteínas.

Existen muchos tipos de detergentes. Nuevos detergentes se encuentran en constante desarrollo, generalmente para aplicaciones específicas [1]. Este artículo repasa las características y aplicaciones de los detergentes más comunes.

TipoQuímicos
iónicosDodecil sulfato de sodio (del inglés SDS), deoxicolato, colato, Sarcosyl
no iónicosTriton X-100, DDM, digitonina, Tween-20, Tween-80
zwitteriónicosCHAPS
caotrópicosurea
Tabla 1. Clasificación de detergentes.

Los detergentes son compuestos orgánicos compuestos por una cadena hidrocarbonada hidrofóbica y un grupo hidrofílico con carga en un extremo. Cuando se disuelven en agua, a una determinada temperatura y concentración, las moléculas de detergente forman micelas, con su porción hidrofóbica en el interior de la micela y el grupo cargado en el exterior (Fig. 1B). El núcleo hidrofóbico de la micela se une a las regiones hidrofóbicas de las proteínas. El número de moléculas de detergente que forman una micela se denomina el número de agregación, un parámetro importante utilizado para evaluar la solubilidad de proteínas de membrana [2]. El largo de la región hidrofóbica es directamente proporcional al grado de hidrofobicidad y es bastante constante entre los detergentes. Los detergentes más comunes se categorizan, según sus características, en tres tipos: iónicos (aniónicos o catiónicos), zwitteriónicos y no iónicos. La concentración de detergente mínima a la cual se forman micelas a una temperatura dada es llamada concentración micelar crítica (CMC). En cualquier concentración menor a la CMC solo se observan monómeros; en concentraciones mayores a la CMC coexisten monómeros y micelas, junto con otras fases no micelares que no se disuelven en agua. De manera similar, la temperatura más baja a la cual se forman micelas es llamada la temperatura micelar crítica (TMC). Tanto la temperatura como la concentración son parámetros importantes de separación de fase y solubilidad de un detergente. En general, una baja lipofilicidad o lipofobicidad resultan en una alta CMC.

Detergentes: Triton X-100, Tween-20, y más Figura 1
Figura 1. Estructura general de monómeros de detergentes. Adaptado de Anatrace.
Detergentes iónicos

Los detergentes iónicos se componen de una cadena hidrofóbica y un grupo terminal cargado, el cual puede ser un catión o un anión. Generalmente tienen valores de CMC mayores que los detergentes no iónicos. Estos detergentes son fuertes.

Los detergentes iónicos no pueden ser removidos por cromatografía de intercambio iónico debido a que poseen un grupo terminal cargado.

Dodecil sulfato de sodio (del inglés, SDS)

El detergente aniónico SDS es un surfactante muy efectivo para solubilizar prácticamente todas las proteínas. Rompe las interacciones no covalentes intra e inter proteicas; por eso las desnaturaliza, lo que resulta en la pérdida de su conformación nativa y de su función. El SDS se une a las proteínas en una relación 1,4 a 1 p/p (o un anión de SDS por cada dos aminoácidos). El SDS le agrega carga negativa a todas las proteínas de una muestra, al margen de su punto isoeléctrico (pI). Esa es la principal razón por la cual se utiliza ampliamente en la electroforesis de geles de poliacrilamida con SDS (del inglés, SDS-PAGE). Para lisar completamente las células en presencia de SDS, generalmente hay que sonicar la muestra o pasarla por una aguja (19G) varias veces para asegurar la degradación del ADN. Nunca debe utilizarse SDS cuando se requieren las proteínas activas o cuando se estudia la interacción entre proteínas. Cuando se utilizan detergentes iónicos deben tomarse precauciones extras ya que algunas de sus propiedades pueden alterarse en búferes de fuerza iónica variable (por ej. la CMC baja de 8 a 0.5 mM cuando la concentración de NaCl aumenta de 0 a 500 mM). Más aún, el SDS precipita a bajas temperaturas, y este efecto es aún más marcado en presencia de sales de potasio. Este fenómeno se puede explotar para remover el SDS de una muestra proteica [3].

Deoxicolato y colato

Deoxicolato y colato entran en esta categoría a pesar de que no contienen un grupo terminal cargado. Sus grupos polares se encuentran distribuidos en diferentes partes de las cadenas.

Sarkosyl

Sarcosyl, también conocido como lauril sarcosinato de sodio, es un surfactante aniónico. Es anfifílico gracias a su cadena hidrofóbica de 14 carbonos (lauril) y el carboxilato hidrofílico. El átomo de nitrógeno en la unión amida se mantiene neutral en cualquier pH. El carboxilato, con un pKa de 3,6, se encuentra cargado negativamente en cualquier solución fisiológica. Además, el Sarcosyl tiene una actividad surfactante muy alta en un amplio rango de pH, y su tensión superficial es de entre 3.4 × 10–2 y 2.9 × 10–2N/m.

El Sarcosyl se prepara a partir de cloruro de lauril y sarcosina en presencia de hidróxido de sodio, y se purifica por recristalización alcohólica, o por acidificación con ácido mineral, separación y neutralización del ácido libre. El Sarcosyl reportado en literatura suele ser de Sigma. Su forma comercial más utilizada de acil sarcosina es una solución acuosa al 30 %.

El Sarcosyl se utiliza ampliamente en formulaciones cosméticas tales como champúes, geles de baño y agentes de limpieza surfactantes. El Sarcosyl se utilizó en concentraciones de 2,78 a 12,9 % en jabones, según análisis cromatográficos de los productos [4]. El Sarkosyl se utiliza en el acabado de metales industriales por sus propiedades anti óxido, anti corrosión y modificantes del cristal. El Sarcosyl también se ha utilizado para mejorar la humectación y penetración de productos farmacológicos tópicos. En la industria alimenticia el Sarkosyl se encuentra aprobado para ser utilizado en el procesado, empaquetado y transporte de comida para el consumo humano, y en adhesivos utilizados en el transporte o almacenamiento de comida.

El Sarkosyl también es utilizado ampliamente en experimentos de laboratorio gracias a su buena solubilidad acuosa, la alta estabilidad de su espuma y su alta capacidad de sorción a proteínas. Puede inhibir la iniciación de la transcripción del ADN. El Sarkosyl sirve como detergente para permeabilizar las células y extraer las proteínas en técnicas de purificación tales como el Western blot y el ELISA indirecto.

Una aplicación muy importante del Sarkosyl es la solubilización y replegamiento de proteínas a partir de cuerpos de inclusión. Proteínas eucariotas recombinantes expresadas en Escherichia coli tienden a formar cuerpos de inclusión. El Sarkosyl puede extraer proteínas en su forma nativa a partir de cuerpos de inclusión. Generalmente se solubiliza un precipitado de cuerpos de inclusión con Sarkosyl al 0,3 %. La incubación de cuerpos de inclusión con soluciones de Sarkosyl al 10 % solubilizó adecuadamente más del 95 % de las proteínas, mientras que una alta tasa de recuperación de proteínas de fusión se obtuvo con Triton X-100 y CHAPS en una proporción específica [5]. Anteriormente se solubilizaban las proteínas de los cuerpos de inclusión con desnaturalizantes tales como urea o cloruro de guanidinio y se las renaturalizaba mediante una dilución lenta. Sin embargo, la mayoría de las proteínas solubilizadas se agregan y precipitan tras la remoción de detergentes fuertes. Se ha determinado que el Sarkosyl es un agente solubilizante efectivo que permite el replegamiento a mayores concentraciones proteicas (tanto como 10 veces más que con cloruro de guanidinio) [6] ). Más aún, el Sarkosyl permite el replegamiento de las proteínas solubilizadas con menos agregación que con urea o cloruro de guanidinio. Las proteínas en los extractos solubles con Sarkosyl pueden ser almacenadas a 4 °C por una semana previo a su purificación por afinidad. Sin embargo, el sarkosyl interfiere con los procesos cromatográficos posteriores y debe ser removido de la solución por dilución o por diálisis.

Detergentes no iónicos

Los detergentes no iónicos tienen grupos terminales hidrofílicos no cargados. Se los considera surfactantes intermedios ya que rompen las interacciones entre lípidos y proteínas y entre lípidos, pero no entre proteínas, y en general, no desnaturalizan las proteínas. Por ende, las proteínas son solubilizadas y aisladas en su estado nativo y activas. Son preferidos para la purificación de proteínas de membrana.

Detergentes: Triton X-100, Tween-20, y más Figura 2
Figura 2. Estructura y fórmula de algunos detergentes comunes. Adaptado de G-Biosciences.
La familia del Triton

El Triton X-100 es un surfactante no iónico típico y el surfactante de elección para la mayoría de los experimentos de inmunoprecipitación. Todos los miembros de esta familia (Triton X-100, Triton X-114, Nonidet P40 [7], Igepal® CA-630) son bastante similares y difieren solo en el número promedio de monómeros por micela (9,6; 8,9; 9,0 y 9,5 respectivamente) y en la distribución del tamaño de los grupos terminales de PEG [8]. El Triton X-100 deriva de polioxietileno y contiene un grupo hidrofóbico alquilfenil. Su valor de CMC es bajo y por ende no puede ser removido fácilmente por diálisis. Su punto de enturbiamiento es de 64oC y a esta temperatura se observa una separación de fases.

Detergentes: Triton X-100, Tween-20, y más Figura 3
Figura 3. Estructura y fórmulas del Tween-20 y el Tween-80.
n-dodecil-β-D-maltósido y otros maltósidos

El n-dodecil-β-D-maltósido (del inglés, DDM) es un surfactante glucosídico, utilizado cada vez con mayor frecuencia para aislar proteínas hidrofóbicas y de membrana en casos en los que se debe conservar la actividad de la proteína. Está demostrado que es más eficiente que otros como el CHAPS o el NP-40 [9]. La cadena glucosídica en su sitio lipofílico, su alta CMC de 0,17 mM y la interface de las micelas crean un microambiente similar al acuoso, ideal para solubilizar y retener la estabilidad de proteínas hidrofóbicas y de membrana.

Otros maltósidos tienen diferentes largos de cadena hidrofóbica, es decir de grupo alquilo. También se puede utilizar octil glucósido (en inglés simplemente “glucoside”) [10-12].

Digitonina

La digitonina, extraído de la Digitalis purpurea, es utilizada para la solubilización de membranas plasmáticas eucariotas. El Sarcosyl y el Triton X-100 solubilizan la membrana interior, pero no la exterior, de las bacterias.

La familia del Tween

El Tween-20 y el Tween-80 son surfactantes polisorbatos con un ácido graso y una cadena de polioxietileno larga. Tienen una CMC muy baja y generalmente son surfactantes suaves, no afectan la actividad de la proteína y son efectivos en su solubilización. No son ingredientes comunes de los búferes de lisis de células; se utilizan de rutina como agentes de lavado en inmunoblots y en ensayos de ELISA para minimizar la unión inespecífica de los anticuerpos y para remover lo que no se encuentra unido.

Una pregunta común con respecto a la familia de detergentes del Tween es cuál es la diferencia entre el Tween-20 y el Tween-80, los dos miembros más utilizados. El Tween-20 tiene ácido láurico, mientras que el Tween-80 tiene ácido oleico, ver figura 3. En la tabla 2 se resumen varias características de ambos. La diferencia es a veces importante, especialmente en estudios in vivo, ya que el Tween-20 y el Tween-80 tienen diferentes efectos hemolíticos [13].

SinónimosFórmula química Peso Molecular Densidad (g/mL) Apariencia Aplicaciones
Tween-20polisorbato 20, polioxietileno monolaurato de sorbitano, monolaurato de polioxietilen(20)sorbitanoC58H114O2612281.1Líquido viscoso claro, entre amarillo y amarillo verdosoun amplio rango de aplicaciones: como agente bloqueante en búferes de lavado de PBS o TBS para ensayos de ELISA, Western blots u otros métodos de inmunoensayo.
Tween-80polisorbato 80, polioxietileno monoleato de sorbitano, monoleato de polioxietilen(20)sorbitanoC64H124O2613101.06-1.09líquido viscoso color ámbarcomo agente estabilizante de proteínas; utilizado en pruebas de identificación del fenotipo de algunas bacterias.
Tabla 2. Características del Tween-20 y del Tween-80

La mayoría de los detergentes no iónicos interfieren con la espectrofotometría de luz UV, especialmente el Triton X-100, ya que contienen un anillo fenólico el cual absorbe luz UV. Por ende, la determinación de proteínas a 280 nm sería imprecisa.

Detergentes zwitteriónicos

Los grupos terminales de los detergentes zwitteriónicos (o anfotéricos) son hidrofílicos y contienen el mismo número de cargas positivas que de negativas, lo que resulta en una carga neta nula. Son más fuertes que los surfactantes no iónicos. Un detergente zwitteriónico típico es el 3- [14] -1-propano sulfonato, mejor conocido como CHAPS. Su CMC (6 mM a temperatura ambiente) permite su remoción eficiente por diálisis. Es muy común en la preparación de muestras para isoelectroenfoque y electroforesis 2D en una concentración de 2 a 4 %. El CHAPSO difiere del CHAPS en que contiene un grupo terminal más polar, lo que lo hace más soluble. Por ende, el CHAPSO se utiliza principalmente en la solubilización de proteínas integrales de membrana.

Agentes caotrópicos

Los agentes caotrópicos son substancias similares a los surfactantes en que rompen las interacciones no covalentes (puentes hidrógeno, interacciones dipolo con dipolo e interacciones hidrofóbicas) facilitando la desnaturalización de las proteínas, lo que en este caso suele ser reversible. La urea sola, o en combinación con tiourea u otros detergentes, es el agente caotrópico más utilizado en aplicaciones de electroforesis 2D y en digestiones enzimáticas de proteínas en solución en los protocolos de proteómica. Cuando se utiliza urea hay que prestar especial atención de no calentar la muestra a más de 37 °C ya que esto lleva a la carbamilación de las proteínas [15].

Detergentes para la aislación de proteínas de membrana

Para solubilizar proteínas de membrana se debe elegir un detergente con alta CMC y el volumen de búfer también es crucial ya que debe haber suficiente detergente como para solubilizar todas las proteínas de membrana de la muestra. De acuerdo a Linke [2], se requiere de por lo menos una micela por cada proteína de membrana para mimetizar de manera suficiente el ambiente de una membrana (Fig. 1C-D). En principio, cambiando la temperatura y la concentración de sales en el búfer se puede lograr una solubilización efectiva de las proteínas de membrana, tomando ventaja de la separación de fases. En este caso, las proteínas de membrana rodeadas de micelas precipitan con el detergente y las proteínas solubles permanecen en el sobrenadante. La temperatura a la cual la solución de detergente se separa en dos fases es llamada punto de enturbiamiento. El punto de enturbiamiento también es afectado por la presencia de aditivos en el búfer, tales como glicerol o sales (por ej. el Triton X114 tiene un punto de enturbiamiento de 23 °C, pero en la presencia de glicerol al 20 % baja a 4 °C). Esto es muy importante ya que la estabilidad de una proteína es afectada por las altas temperaturas.

Elección de detergentes

Un buen detergente debe poder lisar las células, solubilizar las proteínas y ser adecuado para las aplicaciones subsiguientes. Además, también hay que considerar la proteína solubilizada es requerida en su estado nativo o desnaturalizado. No existe un detergente ideal para todas las aplicaciones e inclusive en la misma aplicación el resultado es variable (Tabla 3). Por ende, la mejor estrategia es la de prueba y error, y el uso de una mezcla de detergentes también debe ser evaluado. Además, la utilización de soluciones de detergentes recién preparadas es, en general, una buena práctica para evitar la hidrólisis y la oxidación.

DetergentePM (Da) del monómeroPM (Da) de la micelaCMC (mM) 25oCNúm. de agregaciónpunto de enturbiamiento (oC)Peso micelar promedioPotenciaDializableAplicaciones
SDS28918,0007-1062>10018,000FuerteLisis celular, electroforesis, WB, hibridización
Triton X-10062590,0000.2-0.9100-1556580,000SuaveNoEnzima inmunoensayo
CHAPS6156,150610>1006,150SuaveIEF, IP
NP-4068090,0000.05945-50SuaveNoIEF
n-dodecil-β-D-maltósido5110.159850,000Cristalización de proteínas
Tween-2012280.0676SuaveNoWB, ELISA, Enzima inmunoensayo
Digitonina122970,000<0.56070,000SuaveNoSolubilización de membranas
Tabla 3. Propiedades y aplicaciones principales de los detergentes más comunes. Información de la universidad de Florida BCH6206. WB, Western blot; IP, inmunoprecipitación; IEF isoelectroenfoque
Remoción de detergentes

Las aplicaciones subsiguientes controlan no solo el tipo de detergente sino también su concentración, la cual tiene que ser disminuida o llevada a cero. Para dicho propósito se pueden utilizar la cromatografía de exclusión molecular o la diálisis, pero esto requiere que el tamaño de la micela sea diferente al de la proteína de interés o que las micelas sean lo suficientemente pequeñas (es decir alta CMC) como para atravesar la membrana de diálisis [2]. Otros métodos emplean esferas no polares o resinas que unen detergentes, complejos de inclusión de ciclodextrinas [16], cromatografía de intercambio iónico o precipitación de proteínas. El búfer final, tras la remoción del detergente, debe ser escogido con extremo cuidado para evitar la precipitación y agregación de las proteínas.

Revisión bibliográfica de detergentes, por Labome

Labome revisa las aplicaciones de los detergentes en la literatura. En la siguiente tabla se listan los principales proveedores y el número de artículos en que se citan, siendo Sigma el principal proveedor de detergentes al primero de Agosto de 2014.

DetergenteNúmProveedores
Triton X-10034Thermo Fisher, Amresco, JT Baker, Sigma
Tween-2019Thermo Fisher, Amersham Pharmacia, Bio-Rad
SDS13Amresco, Bio-Rad, Q.BIOgene, Sigma
NP-406Roche, Sigma
CHAPS6EMD Millipore/Merck/Calbiochem, Sigma, JT Baker
digitonina8EMD Millipore/Merck, Sigma, Wako
Tabla 4. Detergentes en revisión bibliográfica de Labome. Núm: número de publicaciones.
Triton X-100

El Triton X-100 de Thermo Fisher Pierce fue utilizado para lisar células y tejidos para experimentos de Western blot [17, 18] e inmunohistoquímica [19]. El Triton X-100 al 30 % de Amresco fue utilizado para homogeneizar la médula espinal de ratas [20]. El Triton X-100 de JT Baker fue utilizado para permeabilizar y fijar células para visualizar el citoesqueleto de actina [21]. El Triton X-100 de Packard se utilizó en solución con anticuerpos primarios para experimentos de inmunohistoquímica [22]. El Triton X-100 de Sigma se utilizó para permeabilizar células en ensayos de inmunohistoquímica [23-31], o en el búfer de bloqueo para ensayos de inmunohistoquímica [32-35], para solubilizar muestras para experimentos de Western blot [36, 37], para lisar muestras de células y tejidos [38-44], en experimentos de PCR [45], en experimentos de fusión de liposomas [11], ensayos de protección de proteinasa K [46], y en tinciones de montaje completo [47].

Tween-20 y Tween-80

El Tween-20 suele ser utilizado en búferes de lavado, tales como el TBS-T y el PBS-T, en varios inmunoensayos.

El Tween de Fisher al 0,05 % se utilizó en experimentos de ELISA [48]. El Tween-20 de Amersham Pharmacia se utilizó para Western blot [49]. El Tween-20 de Bio-Rad se utilizó para el análisis de inmunoblots [38] y para lavar secciones de tejido en experimentos de inmunohistoquímica [50]. El Tween-20 de Sigma se utilizó para lavar membranas de Western blot [25, 37], [51], [52], [53-56], en experimentos de ELISA [57, 58], en inmunoprecipitaciones [59], en hibridizaciones in situ [60], y para colecciones de PCR múltiples microfluídicas [61] y otras [62, 63].

El Tween-80 de Sigma se utilizó para disolver erlotinibse [64] y como suplemento para crecer cepas de M. tuberculosis [65].

SDS

El SDS de Amresco se utilizó en experimentos de electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS [66]. El SDS de Bio-Rad se utilizó para preparar el búfer de radioinmunoprecipitación [67]. El SDS de Q.BIOgene se utilizó para preparar el búfer de homogeneización de precipitados para experimentos de Western blot [68]. El SDS de SIGMA se utilizó para preparar búferes para, entre otros, ensayos de octanoilación in vitro, muestras de Western blot, experimentos de 2D-DIGE [37, 39, 40, 62, 69-74]. El SDS al 10 % de Sigma se utilizó para homogeneizar la médula espinal de ratas [20].

NP-40

El NP-40 de Roche se utilizó para lisar células [75, 76], el NP-40 de Sigma se utilizó para preparar el búfer de ensayos de radioinmunoprecipitación [67], búfer de lisis [77], búfer de homogeneización [78] y el búfer RIPA de inmunoprecipitación [31].

CHAPS

La solución de CHAPS (2 % p/v) de Calbiochem se utilizó para identificar marcadores proteicos de cáncer de ovario [48]. El CHAPS de Sigma se utilizó en búferes para purificar progrelina recombinante de ratón [70], en ensayos de inmunoprecipitación [31], lisis tisular [79], y en la cristalización de proteínas [80]. El CHAPS de JT Baker se utilizó para lisar células en el estudio de la interacción de un virus con la proteína humana ASF1 [81].

Digitonina

La digitonina de MERCK se utilizó en experimentos de inmunohistoquímica para estudiar el rol de PI4P respecto de la identidad de la membrana [82]. La digitonina de Sigma se utilizó para permeabilizar células para estudiar las respuestas epiteliales y mesenquimales frente a la toxina 1 de Escherichia coli [83], para estudiar la autofagia [84], para preparar el búfer de extracción para estudiar el efecto de TNF alfa sobre los macrófagos [85], para realizar ensayos de protección de proteinasa K [46], y para extraer ARN [86]. La digitonina de Wako se utilizó para lisar células [87] y para realizar inmunoprecipitaciones [88].

Maltósidos y octil glucósido

El n-decil-beta-D-maltopiranósido de Anatrace se utilizó para la purificación de proteínas [89] y a una concentración 5 mM [90] ; al igual que su n-dodecil-beta-D-maltósido [91-95] y su n-undecil-beta-D-maltósido [94, 96]. El beta-dodecil-maltósido y el beta-decil-maltósido de Glycon se utilizaron en la purificación de proteínas [12]. El n-dodecil-beta- maltósido de Sigma se utilizó al 1 % para realizar ensayos de inhibición de corte por tripsina [97] y el decil maltósido se utilizó para aislar proteínas [98].

El octil- glucósido de Glycon se utilizó en la purificación de proteínas [11] y en el marcado de proteínas [12], y el n-octil-beta-glucósido de Anatrace se utilizó en experimentos de pulso y caza [10].

Otros

Para la purificación de proteínas se utilizaron el octil glucosa neopentil glicol (OGNPG) de Affymetrix al 1 % [99], y el colesteril hemisuccinato de Sigma al 0.1 % (p/v) [100].

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