Marcadores celulares neuronales
Patima Tanapat (patima dot tanapat at gmail dot com)
Princeton, New Jersey, United States
Translator
Agustin Carbajal (quiocarbajal at gmail dot com)
Cordoba, Argentina
DOI
//dx.doi.org/10.13070/mm.es.3.196
Date
fecha : 2018-05-25; original version : 2013-06-05
Cite as
MATER METHODS es 2013;3:196
Resumen

Análisis exhaustivo de los marcadores inmunohistoquímicos para células neuronales del SNC

English Abstract

A comprehensive review of immunohistochemical markers for CNS neuronal cell types.

Introducción

Las neuronas son los componentes básicos de la señalización del cerebro. Por consiguiente, una parte fundamental de cualquier intento de entender cómo funciona el cerebro como un todo es la investigación de los diferentes tipos celulares neuronales. Con este fin, los marcadores inmunohistoquímicos han demostrado ser una de las herramientas más valiosas de los neurocientíficos. Utilizando anticuerpos contra diferentes componentes celulares, los científicos pueden identificar células que expresan un fenotipo neuronal y, más aún, recolectar información acerca de sus características morfológicas y expresión de proteínas específicas

A continuación se analizarán los diferentes medios que permiten diferenciar los distintos tipos de células neuronales. Además, dado que es de suma importancia poder diferenciar entre neuronas y otros tipos celulares cerebrales, también se dará una breve descripción de estos otros tipos celulares. Finalmente, se discutirá el uso de la inmunohistoquímica como herramienta para examinar poblaciones de neuronas, enfocando en los marcadores utilizados más frecuentemente y algunas consideraciones clave a la hora de elegir un marcador para un estudio en particular.

Células del cerebro
Neuronas

Las neuronas se componen de cuatro áreas morfológicamente distintas: un cuerpo celular (soma), las dendritas, el axón y las terminales presinápticas. La estructura altamente especializada de estas células les permite propagar señales eléctricas, o potenciales de acción, que son la base de la comunicación entre las neuronas. El soma es el centro metabólico de la célula. Alberga el núcleo, el cual contiene el ADN celular, así como otros orgánulos. Del soma emergen dos tipos de proyecciones. El primer tipo, llamado dendrita, recibe información que entra a la neurona mientras que el segundo tipo, el axón, traslada la información que sale de la misma. Típicamente, una neurona tendrá muchas dendritas. Cada una de estas dendritas puede a su vez contener cientos a miles de espinas, las cuales son el sitio de entrada de axones de otras neuronas (cabe mencionar que los axones también hacen sinapsis en el soma o en el axón, aunque esto es menos frecuente). El axón emerge desde una región especializada del soma celular, llamada cono axonal, y es responsable de la propagación del potencial de acción. En su extremo se divide en varias ramas que terminan en las sinapsis. Aunque se dice que la sinapsis es el punto de contacto entre dos neuronas, las células en realidad no hacen contacto físico, sino que se encuentran separadas por un espacio llamado espacio sináptico. Al final de cada rama axonal se encuentra la terminal presináptica, que contiene vesículas llenas de neurotransmisores. Cuando un potencial sináptico alcanza la terminal, el contenido vesicular es liberado dentro del espacio sináptico permitiendo la comunicación química con la célula postsináptica.

Glía

El cerebro también está compuesto de otras células, además de las neuronas, llamadas glía. Las células gliales proveen soporte estructural y metabólico a las neuronas. Se pueden clasificar, a grandes rasgos, como macroglía y microglía. La macroglía se encuentra presente en condiciones fisiológicas tanto en el desarrollo como en la adultez. Existen cuatro tipos principales de macroglía: astrocitos, oligodendrocitos, células ependimarias y glía radial. Las células de la astroglía dan soporte y nutren a las células del cerebro. Mantienen el balance iónico y asisten en el soporte bioquímico de las células endoteliales, manteniendo la barrera hematoencefálica (BHE). Los oligodendrocitos son los responsables de la producción y el mantenimiento a largo plazo de la mielina, la cual aísla los axones neuronales y facilita la propagación de los potenciales de acción. Las células ependimarias forman el revestimiento de los ventrículos, las cavidades del cerebro que contienen el líquido cefalorraquídeo. También dan origen a la capa epitelial que rodea el plexo coroideo, el cual produce el líquido cefalorraquídeo, actuando como una interfase entre la sangre y el SNC. La glía radial, la cual se caracteriza por contener proyecciones radiales largas, colabora en la migración de las neuronas; juega un papel en el modelado y la diferenciación específica, acorde a cada región, del SNC; y han sido identificadas como precursoras de neuronas y de glía [1, 2].

La microglía deriva de progenitores mieloides de médula ósea y juega un papel crítico en la mediación de las respuestas inmunes celulares del SNC, incluyendo la presentación de antígenos de superficie y la promoción de la inflamación a través de la secreción de varias citoquinas [3]. Tienen la capacidad de eliminar los restos celulares por fagocitosis y de secretar factores que pueden alterar la progresión de las enfermedades [4]. Se cree que durante el desarrollo la microglía tiene un papel en el remodelamiento sináptico, la apoptosis, la limpieza fagocítica y la angiogénesis [5]. Se ha descripto que, durante la adultez, la microglía participa en la regulación de la muerte celular, la eliminación de sinapsis, la neurogénesis, la vigilancia neuronal y la remodelación de la vasculatura del SNC bajo condiciones patológicas [5, 6]. Estas observaciones sugieren que la microglía es importante para la maduración y la plasticidad de los circuitos neuronales, y de los comportamientos regulados por estos circuitos. En línea con esta idea, se ha propuesto que la disfunción de la microglía puede contribuir al desarrollo de desórdenes psiquiátricos y neurológicos [4].

Tejidos microvasculares del cerebro

Las células endoteliales que conforman la microvasculatura del cerebro también son relevantes en nuestro análisis sobre células no neuronales. Estas células forman la barrera hematoencefálica junto con los astrocitos. La BHE regula estrictamente el movimiento de iones, moléculas y células entre la sangre y el SNC, proporcionando el ambiente adecuado para la función neuronal, así como la protección contra daños y enfermedades. Uno de las funciones principales de la BHE es evitar la entrada de sustancias tóxicas desde la sangre hacia el cerebro.

Identificación de tipos celulares neuronales

La primera persona en descubrir la gran diversidad que existe dentro de la población neuronal fue el padre y fundador de la neurobiología, Santiago Ramon y Cajal. Utilizando el método de tinción con plata de Camillo Golgi, pudo de observar las muy diferenciadas características de neuronas individuales. Al hacer esto, se dio cuenta de que las células que componen el cerebro varían enormemente tanto en tamaño como en forma. Mientras que algunas neuronas, como las células granulosas, mostraban proyecciones relativamente simples que surgían de un cuerpo celular pequeño, otras, como las células cerebelares de Purkinje, se caracterizaban por poseer proyecciones muy complejas y floridas.

A partir del descubrimiento inicial de Cajal los científicos han podido distinguir cientos de tipos de células neuronales. Sin embargo, sigue sin encontrarse un sistema de clasificación unificado . Esto es, en parte, debido al hecho de que los nombres asignados a las diferentes células tienden a variar en el grado de exactitud descriptiva. Más aun, a menudo las diferentes categorías de neuronas se superponen, dando lugar a la asociación de un tipo celular en particular con varios nombres diferentes. Sin embargo, en general las neuronas pueden ser clasificadas de acuerdo a criterios que incluyen la morfología, los patrones de las proyecciones, las propiedades electrofisiológicas y las características bioquímicas.

Ejemplos de clasificaciones basadas en la morfología (por ej. tamaño, forma del soma y patrones dendríticos) son, probablemente, los más comunes en la literatura científica. Si bien la morfología proporciona una forma obvia y accesible de caracterización, el sentido de su uso reside en su importancia funcional. Debido a que la forma de una neurona es determinada por los estímulos que recibe y las células diana sobre las cuales se proyecta, la estructura neuronal es un reflejo directo de la conectividad celular subyacente y, por ende, también de su función. Tomemos por ejemplo las formas de las fibras y ramas ascendentes de los axones de las células granulosas en el cerebelo. Aquí, la forma axonal es determinada por las conexiones específicas con las dendritas de las células de Purkinje, en donde el árbol axonal hace numerosos contactos con una sola dendrita [7]. De manera similar, la examinación de las clásicas células piramidales puede ilustrar la información revelada por la morfología. El término “células piramidales” se refiere, a grandes rasgos, a células que poseen un soma largo y triangular, con distintos grupos de dendritas apicales y basales. Esta organización estructural sugiere el papel que juegan estas células en la incorporación de información proveniente de diferentes capas celulares en un mensaje integrado que es comunicado a otra región del cerebro [8].

Otra distinción estructural importante que suele hacerse a menudo se basa en las proyecciones axonales de una neurona. Las células que extienden su axón más allá de la población separada de neuronas a las cuales pertenecen (i.e., el núcleo) se denominan neuronas de proyección, mientras que aquellas que hacen conexión sináptica solo dentro de su núcleo se llaman interneuronas, o neuronas intrínsecas. Hay que recalcar que estos términos se refieren solamente a las proyecciones axonales y no al origen de sus estímulos. Por tanto, una neurona de proyección podría recibir solo estímulos locales mientras y una neurona intrínseca podría recibir estímulos de otro núcleo. La identificación de estos patrones de conectividad es importante, ya que proporcionan información sobre el procesamiento del flujo información que subyace a la función asociada a dicha población celular. De hecho, este concepto clave es la base del gran esfuerzo que recientemente se ha realizado para completar los mapas completos de las conexiones en el cerebro, denominados “conectoma” [9].

Los tipos de células neuronales también pueden ser clasificados en base a sus propiedades electrofisiológicas. Por ejemplo, las neuronas neocorticales, las cuales exhiben diferencias significativas en sus patrones de respuesta de acciones de potencial, habitualmente se clasifican como neuronas de disparos regulares (RS, por sus siglas en inglés), de disparos rápidos (FS, por sus siglas en inglés) y de estallido. Las neuronas de disparos regulares se adaptan fuertemente en respuesta de estímulos constantes, mientras que las neuronas de disparo rápido mantienen una frecuencia de disparo alta, casi sin adaptarse, y las neuronas de estallido generan grupos de disparos de manera única o repetitiva [10, 11]. La diversidad de los patrones intrínsecos de disparo de estas células es significativa en el hecho de que representa un nivel adicional de regulación en el cual se puede modularse la respuesta de estas células frente al estímulo.

En relación con los criterios de diferenciación descritos hasta ahora, la inmunohistoquímica puede utilizarse para aportar información sobre la morfología y, hasta cierto punto, sobre las proyecciones axonales de diferentes poblaciones de neuronas. Sin embargo, el verdadero punto fuerte de la metodología, en el contexto de la fenotipificación neuronal, reside en su potencial para distinguir células en base a sus características bioquímicas. De hecho, tal como se describirá en las próximas secciones, la clasificación de las neuronas por su relación con el sistema de un neutrotransmisor en particular o la expresión de un gen o proteína específica es un método utilizado con frecuencia.

Inmunohistoquímica como herramienta para la identificación de tipos de células neuronales

A pesar de que la tinción de Golgi sigue siendo una herramienta útil para la identificación neuronal, la técnica conlleva ciertos inconvenientes. Probablemente, el más importante es queincluso cuando se realiza correctamente, la tinción tiende a ser variable. Si bien se puede lograr una tinción completa del árbol dendrítico, las ramas axonales y las finas arborizaciones terminales distales son difíciles de teñir completamente [12]. Además, por razones aún desconocidas, se estima que la tinción sólo ocurre en un 1 a 10 % de las células [13, 14]. Si bien este aspecto del protocolo es precisamente lo que le permitió a Cajal descubrir que las neuronas son entidades independientes, también dificulta el marcaje de células específicas y aumenta la cantidad de tejido requerido para alcanzar un tamaño de muestra (estadística) apropiado.

En los 70, con la aparición de métodos inmunohistoquímicos para la identificación de tipos celulares, los investigadores pudieron superar algunas de las dificultades técnicas asociadas a métodos más antiguos como la tinción de Golgi. Por aquel entonces, los investigadores habían comenzado a utilizar la inmunohistoquímica para identificar neuronas que contenían las enzimas de síntesis de las monoaminas: la tirosina hidroxilasa (TH), la dopamina beta hidroxilasa (DBH) y la triptofano hidroxilasa (TrH) [15, 16]. Sin embargo, el florecimiento de la inmunohistoquímica como herramienta para la identificación de células neuronales no sucedió hasta que se publicó el uso de las enolasas de cerebro, neuronales y no neuronales, como marcadores específicos de células neuronales y gliales respectivamente [17]. Le siguieron otros estudios que describían el inmunomarcaje de una variedad de antígenos expresados de manera diferencial en células tipo neuronales, incluyendo la glicoproteína externa grande inducible por el factor de crecimiento neuronal (del inglés, NILE-GF) [18], la acetiltransferasa de colina [19], parvalbúmina [20], y la proteína de neurofilamentos [21, 22]. Si bien no todos estos siguen siendo ampliamente utilizados en este contexto, el impacto de la estrategia metodológica ha mantenido su importancia.

En su momento, en la mayoría de los casos se desconocía la naturaleza y las propiedades funcionales de los antígenos neuronales que se utilizaban. Sin embargo, no perdían utilidad ya que se expresaban en poblaciones neuronales específicas. Además, el uso de la inmunohistoquímica tenía unas ventajas importantes. La metodología era técnicamente muy accesible y la inmunohistoquímica combinada se podía usar para detectar la colocalización de marcadores neuronales con multitud de otros marcadores funcionales.

Más recientemente se han desarrollado estrategias moleculares que están ayudando a dilucidar las características neuronales. Hoy por hoy los investigadores disponen de métodos que utilizan moduladores transcripcionales y recombinasas específicas de sitio para marcar poblaciones neuronales específicas [23]. Sin embargo, la inmunohistoquímica se las ha arreglado para mantener su estatus de metodología principal en la identificación de células neuronales, ya que es relativamente económica, requiere de poco equipamiento especializado y utiliza reactivos que se encuentran ampliamente disponibles. Más aún, se pueden utilizar métodos de microscopía rutinarios para la recolección de datos y, dependiendo del método de visualización, el tejido inmunomarcado puede ser conservado como referencia.

Actualmente los investigadores tienen un amplio número de marcadores inmunohistoquímicos a su disposición para facilitar la distinción del fenotipo de las células en el cerebro. En la siguiente sección se analizaran algunos de los marcadores utilizados más frecuentemente para la identificación de neuronas y de glía.

Marcadores neuronales
Enolasa específica de neuronas (del inglés,NSE)

La NSE, también referida como gama enolasa o enolasa 2, es una proteína citosólica expresada por neuronas maduras y células de origen neuronal (Figura 1). Es una enzima glicolítica específica de cerebro que juega un papel importante en el metabolismo energético intracelular [24]. Durante el desarrollo los niveles de NSE son bajos, pero luego aumentan durante la maduración morfológica y funcional de las neuronas [25].

Si bien la NSE es un marcador neuronal ampliamente aceptado, cabe remarcar que se ha descrito su expresión en células gliales en ciertas condiciones. Concretamente, se han detectado niveles de actividad, proteína y ARNm de la NSE en oligodendrocitos en cultivo similares a aquellos encontrados en neuronas en cultivo [26]. Su expresión aumenta durante la diferenciación oligodendrocítica pero se reprime una vez que la célula madura. En condiciones patológicas también se detecta la NSE en neoplasias gliales y en células gliales reactivas [27].

Núcleos Neuronales (del inglés, NeuN)

En 1992, Mullen et al. reportaron la generación de un anticuerpo monoclonal que reconocía una proteína de localización nuclear específica de neuronas de vertebrados (Figura 2) [28]. Esta proteína, a la cual llamaron Núcleos Neuronales (del inglés, NeuN), fue detectada en la mayoría de los tipos celulares neuronales del sistema nervioso central y periférico de ratones adultos. La expresión de NeuN se corresponde temporalmente con la salida de las células neuronales del ciclo celular y/o con la iniciación de la diferenciación terminal. La proteína es detectable tanto en neuronas embrionarias como adultas, con las excepciones de las células cerebelares de Purkinje, las células mitrales del bulbo olfactorio, las células fotoreceptoras de la retina y las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra [29, 30].

Marcadores celulares neuronales  Figura 2
Figura 2. Ejemplo de marcación de NeuN en neuronas de neocórtex de ratón. Reproducido de la figura 3B de [77].

A pesar del ampio uso de la detección inmunohistoquímica de NeuN ha sido utilizada ampliamente, su función era desconocida hasta recientemente. Ahora los investigadores han podido identificar a NeuN como Fox 3, una proteína involucrada en la regulación del esplicing del ARNm [31]. Dado que Fox 3 se expresa exlusivamente en neuronas, se ha cree que juega un papel en la regulación de la diferenciación celular y el desarrollo del sistema nervioso [31].

Proteína asociada a microtúbulos 2 (del inglés, MAP 2)

MAP 2 es una proteína específica del citoesqueleto neuronal que se utiliza como un marcador de fenotipo neuronal [32]. Se expresa en el sistema nervioso de vertebrados, tanto en tejidos embrionarios como adultos. Su expresión es débil en precursores neuronales pero se acentúa más tarde (aproximadamente un día después de la expresión de la isoforma III de tubulina, específica de neuronas) [33]. Estudios en ratas indican la existencia de al menos 3 isoformas incluyendo la 2a, 2b y 2c. MAP 2c aparentemente se expresa solo durante el desarrollo temprano y solo en axones. MAP 2c sería remplazada por MAP 2a en el transcurso de la maduración. Por el contrario, se ha visto que MAP 2b se expresa a lo largo de toda la vida.

Se cree que la proteína MAP 2 está involucrada en el ensamblaje de los microtúbulos, actuando como un estabilizador en su crecimiento mediante el entrecruzamiento con filamentos intermedios y otros microtúbulos. En concreto, podría ser relevante en la determinación y estabilización de la forma del árbol dendrítico durante el desarrollo neuronal y por ello se observa sólo dentro del árbol dendrítico [34]. En general, su expresión parece limitarse a neuronas y a astrocitos reactivos [35].

Tubulina βIII (TuJ1)

Se cree que TuJ1 es una tubulina involucrada específicamente durante la diferenciación de tipos celulares neuronales [36]. Las tubulinas son los principales bloques de construcción de los microtúbulos, los cuales son componentes estructurales del citoesqueleto con funciones atribuidas en el mantenimiento de la estructura celular, en la mitosis, meiosis y en el transporte intracelular, entre otras. Correspondientemente, marcaje inmunohistoquímico de Tuj1 se encuentra en el cuerpo celular, dendritas, axones y terminaciones axonales de neuronas inmaduras. Una de las ventajas significativas asociadas al uso de la detección inmunohistoquímica de Tuj1 es el grado de detalle con el que revela axones y terminaciones (Figura 3). De hecho, se ha demostrado su utilidad para detectar alteraciones en la composición del citoesqueleto somático debidas a lesiones [37]. Aunque las células gliales expresan una forma de β tubulina , ésta no es reconocida por los anticuerpos contra Tuj1 [37].

Marcadores celulares neuronales  Figura 3
Figura 3. Células del giro dentado de ratón adulto con doblecortina marcada. Reproducido de la figura 5 de [78].
Doblecortina (del inglés, DCX)

DCX se expresa ampliamente en neuronas migratorias y se observa en etapas tempranas del desarrollo neuronal [38]. Es una proteína asociada a microtúbulos que se expresa en neuronas posmitóticas y se ha propuesto que desempeña una funciónen el borde frontal de las proyecciones neuronales en crecimiento [39]. De acuerdo con este rol, el inmunomarcaje de DCX parece más intenso en las extremidades de las neuritas y continúa hasta las regiones proximales del cono de crecimiento, pero no en las puntas.

c-fos

La activación de c-fos ha sido utilizada como un marcador de activación neuronal [40, 41].

Marcadores neuronales clínicamente significativos

Cabe destacar que existen marcadores de fenotipo celular neuronal que son de especial interés debido a su utilidad para el estudio de la patología de enfermedades clínicas. Dos de ellos son la acetiltransferasa de colina y la tirosina hidroxilasa.

Acetiltransferasa de colina (del inglés, ChAT)

ChAT es la enzima responsable de catalizar la síntesis de acetilcolina. Dado que se expresa en la gran mayoría de las neuronas colinérgicas, la inmunoreactividad de la ChAT se utiliza generalmente como un biomarcador de disminución cognitiva en varios desórdenes neurodegenerativos. Su detección ha sido una herramienta importante para investigar los cambios neurológicos típicos de la enfermedad de Alzheimer, que se asocia a una pérdida sustancial de neuronas colinérgicas en el prosencéfalo basal. Estudios post mortem han utilizado la inmunomarcación de la ChAT para revelar disminuciones en la densidad de las fibras y de las varicosidades de los axones de neuronas positivas para ChAT en el prosencéfalo superior y en la amígdala de pacientes con deterioro cognitivo [42, 43]. Además, la inmunohistoquímica ha sido utilizada en modelos animales para evaluar la capacidad de alterar, por manipulación experimental, el número de neuronas positivas para ChAT en los núcleos septales y el área de Broca [44, 45]. El inmunomarcaje también se ha utilizado para visualizar neuronas colinérgicas para determinar la interrupción de la red de fibras positivas para la ChAT, así como cambios en la morfología general en regiones que incluyen el giro cingulado, la corteza sensorial y el prosencéfalo basal [46, 47].

Tirosina hidroxilasa (TH)

De manera similar, la inmunohistoquímica para la enzima TH ha sido una herramienta importante en la investigación de la enfermedad de Parkinson, una condición caracterizada por trastornos del movimiento asociados a una pérdida de células dopaminérgicas en la sustancia negra. La enzima TH regula la síntesis de dopamina (así como de epinefrina y norepinefrina). En estudios post mortem se ha utilizado la inmunohistoquímica de la TH para cuantificar el grado de pérdida de células dopaminérgicas en pacientes con Parkinson [48]. Para determinar si este tipo de pérdida puede ser mitigada por intervención quirúrgica se ha utilizado la inmunohistoquímica de TH para evaluar los efectos protectores de varios procedimientos experimentales en modelos animales de Parkinson [49, 50].

Otros marcadores de neuronas

Además de los marcadores que se han descripto arriba, existen muchos otros marcadores asociados a neuronas comercialmente disponibles (Tabla 1).

MarcadorLocalizaciónFunciónNeuronas asociadas
Molécula de adhesión celular neural polisiálica ácida (del inglés, PSA NCAM)Membrana plasmáticaMolécula de adhesión celular neural que se cree que juega un papel en la regulación de la forma celular, el crecimiento o la migración durante el desarrollo; se cree que está involucrada en la plasticidad sináptica inducida por actividad en la adultez [51] expresada en poblaciones de neuronas inmaduras
Diferenciación neurogénica 1 (del inglés, NeuroD o Beta2)Citoplasma y núcleoFactor de transcripción expresado en algunas partes del cerebro; involucrado en la diferenciación del sistema nervioso; requerido para la correcta diferenciación de microneuronas originadas posnatalmente, su ausencia resulta en la muerte celular [52] expresada en poblaciones de neuronas inmaduras
TauPorciones distales de los axones, no se encuentra presente en dendritas*Proteína altamente soluble asociada a microtúbulos, encontrada principalmente en neuronas (en comparación con células no neuronales) [53] ; modula la estabilidad del citoesqueleto y provee flexibilidad axonal [54] abundante en neuronas del SNC; también expresada en bajos niveles en astrocitos y oligodendrocitos del SNC
Calbindina-D28kcuerpos celulares, dendritas y espinas; matriz del citoplasmaProteína de unión a calcio; juega un papel en el amortiguamiento rápido del calcio [55] Neuronas de Purkinje; expresada en células neuroendocrinas
CalretininacitosolProteína de 29 kDa con un 58% de homología con la calbindina-d28; la primer proteína de unión a calcio en expresarse en el sistema nervioso central de vertebrados [56] ampliamente distribuida en diferentes poblaciones neuronales incluyendo el subgrupo de interneuronas corticales
Proteína de neurofilamento (del inglés, NFP)axonesproteína del citoesqueleto neural; filamento intermedio, provee soporte estructural a los axones y regula el diámetro axonal [24, 57] ampliamente distribuida en diferentes poblaciones neuronales; sus niveles son relativamente bajos en algunas neuronas
Tabla 1. Otros marcadores del SNC comúnmente utilizados.
Marcadores de glía
Proteína ácida fibrilar glial (del inglés, GFAP)

Sin lugar a dudas, uno de los marcadores de células astrogliales más utilizado es la GFAP. La GFAP es un filamento intermedio que forma una red que proporciona soporte y fuerza a las células. Se cree que controla su forma, movimiento y funciones. Bajo ciertas condiciones de daño (trauma o enfermedad) las células astrogliales incrementan rápidamente su producción de GFAP [58]. Más recientemente se han identificado un número de isoformas de GFAP [59], incluyendo GFAPδ, la cual se expresa en la glía radial proliferativa durante el desarrollo así como en células madre neurales durante la adultez [60].

Marcadores celulares neuronales  Figura 4
Figura 4. Marcación de GFAP en célula de hipocampo de rata. Barra de escala = 15 µm. Reproducido de la figura 6D1 de [79].
S100β

S100β es una proteína expresada por un subtipo de astrocitos maduros que recubren los vasos sanguíneos y por células que expresan NG2, las cuales se cree que son precursoras de oligodendrocitos y subpoblaciones de astrocitos [61, 62]. S100β ha sido implicada en numerosas funciones, incluyendo la extensión de neuritas, la astrocitosis, la proliferación axonal y la inhibición del ensamblado microtubular [63, 64]. Adicionalmente, se ha encontrado que la S100β actúa como un factor neurotrófico durante el desarrollo y que se incrementa bajo ciertas circunstancias de daño durante la adultez [63].

Vimentina

El filamento intermedio vimentina es un componente citoesquelético de las células astrogliales. También la expresa la glía radial y juega un rol importante durante el desarrollo. Más concretamente, se cree que organiza proteínas críticas involucradas en la fijación, migración y señalización celular, a través de un mecanismo de fosforilación [65]. Bajo condiciones de daño, la vimentina participa en la activación de la microglía [66] y se la asocia con la migración de los astrocitos reactivos próximos al lugar del foco del daño [67]. En general, la vimentina se ha utilizado como un marcador fiable de glía. Sin embargo, cabe destacar que también se ha descrito su expresión en neuronas durante períodos del desarrollo y bajo condiciones de daño [68].

2', 3'-nucleótido cíclico 3'-fosfodiesterasa (CNPasa o, CNPase en inglés)

La CNPasea es una enzima presente en altos niveles en el sistema nervioso central y periférico. Se encuentra casi exclusivamente en oligodendrocitos (y en células de Schwann) [69] y se cree que es importante para la mielinización del SNC [70]. La CNPasa aparece de manera temprana durante el desarrollo en oligodendrocitos, comparada con muchas otras proteínas de mielina, de manera temprana durante el desarrollo en oligodendrocitos, y continúa expresada en oligodendrocitos en animales adultos [71]. Esta proteína se encuentra unida a membrana y puede unir a la tubulina a las membranas y también regular la distribución citoplasmática de los microtúbulos [72].

Marcadores de microvasculatura
Antígeno de barrera endotelial (del inglés, EBA)

En general, la morfología característica de la microvasculatura servirá para distinguir las células endoteliales. Sin embargo, el marcador de microvasculatura EBA puede ser utilizado para establecer, de manera definitiva, la identidad de estas células. A diferencia de otros marcadores de microvasculatura, EBA es un marcador inmunohistoquímico de microvasos sanguíneos normales del sistema nervioso central, es decir, se expresa específicamente en el sistema nervioso. La proteína se localiza en la membrana plasmática de las células endoteliales de la microvasculatura. La expresión de EBA se reduce drásticamente bajo condiciones de permeabilización de la barrera hematoencefálica y tras una lesión traumática del cerebro, en el área de contusión. En la actualidad, no se comprende del todo el papel de EBA dentro de la función de la barrera hematoencefálica. Sin embargo, estudios en rata han demostrado que la neutralización inmunológica de EBA produce la disrupción de la BHE, indicando su importancia en mantención la integridad de la BHE [73].

Eligiendo un marcador inmunohistoquímico apropiado

La selección de un marcador neuronal apropiado depende del objetivo del estudio. En casos en los que el objetivo principal es establecer un fenotipo neuronal se pueden utilizar marcadores como NeuN o MAP2. Anticuerpos contra estos marcadores se han utilizado ampliamente y sus propiedades de marcación y distribución se encuentran muy bien caracterizadas [28, 31, 33, 74]. Si bien cualquiera de estos marcadores puede ser útil en estudios que requieran de la determinación del número total de neuronas o de la densidad de neuronas, NeuN tiende a ser el marcador elegido para este tipo de propósitos. Esto probablemente se pueda atribuir a su patrón de marcación nuclear compacto, lo que facilita la recolección cuantitativa de datos comparado con el marcaje disperso de las dendritas típico de MAP 2. Más aún, dado que las aplicaciones para contar células suelen emplear algoritmos de detección automática, el alto contraste (es decir, la relación señal/ruido) que resulta de su forma compacta es muy útil.

MarcadorAcceso en UniprotID del genNúmPrincipales proveedores
NSE P09104 811 Dako (3), Life Technologies Corporation (2), Thermo Scientific Pierce Products (1)
NeuN A6NFN3 98 EMD Millipore (8), Dako (1)
MAP2 P11137 3648 Sigma-Aldrich (15), EMD Millipore (11), BD Biosciences (3)
Tuj1 Q13015 67BioLegend (4), EMD Millipore (1), Sigma-Aldrich (1)
DCX O43602 66 Santa Cruz Biotechnology (5), EMD Millipore (1)
GFAP P14136 8085 Dako (35), Sigma-Aldrich (19), EMD Millipore (12)
S100beta P04271 1820Dako (10), Life Technologies Corporation (2), Sigma-Aldrich (2)
vimentina P08670 6171 Dako (23), Sigma-Aldrich (13), Santa Cruz Biotechnology (4)
CNPase P09543 89 Sigma-Aldrich (2), Abcam (1), Thermo Scientific Pierce Products (1)
Tabla 2. Número de publicaciones (Núm) que citan el uso de marcadores inmunohistoquímicos de neuronas o glía entre 10.113 publicaciones analizadas por Labome.

Algunas veces, los estudios pueden tener otros objetivos que requieran de marcadores adicionales. Por ejemplo, cuando se quiere distinguir a las neuronas en base a sus neurotransmisores, se pueden utilizar anticuerpos contra los receptores de los neurotransmisores o contra las enzimas asociadas a esos neurotransmisores. Estos marcadores estan ampliamente disponibles, incluyendo algunos para neuronas glutamatérgicas, GABAérgicas, colinérgicas o serotoninérgicas. En otras situaciones se puede necesitar de un marcador que sea compatible con otros marcadores inmunohistoquímicos o con otras metodologías. Este suele ser el caso de los estudios de neurogénesis, los cuales típicamente involucran la marcación combinada de las células utilizando al mismo tiempo un marcador de proliferación, tal como la bromodeoxiuridina o la timidina tritiada, y marcadores neuronales de la región del cerebro que está siendo examinada. Además, dependiendo del momento tras la división celular que se pretenda analizar, estos estudios suelen requerir de marcadores que se expresan en un momento específico posterior a la salida del ciclo celular. Dado que la expresión proteica depende de la etapa de la diferenciación celular, la elección del marcador afectará al número de neuronas nuevas que se identificarán. En situaciones en las cuales la tasa de diferenciación de células recién nacidas varía entre grupos, puede ser necesario utilizar un grupo de marcadores para detectar diferencias entre neuronas en distintos estadios de diferenciación.

Más allá de establecer un fenotipo neuronal, los marcadores inmunohistoquímicos también revelan información acerca de las características morfológicas de una neurona. Los anticuerpos específicos de neuronas pueden ser útiles para revelar la arquitectura celular. Sin embargo, el marcado está determinado por la distribución de la proteína diana dentro de la célula, la cual variará entre el núcleo, el soma, la dendrita y el axón. Por ende, el tipo de información que puede ser recogida depende de la localización de dicha proteína. Un estudio describe el uso de un anticuerpo contra un tipo de neurofilamento presente en el árbol dendrítico para corroborar datos que indicaban cambios en las ramificaciones dendríticas [75]. Un desarrollo interesante relacionado a este enfoque ha sido la introducción de marcadores panneuronales, los cuales incluyen una combinación de marcadores que permiten la visualización de toda la citoarquitectura de la neurona de una sola vez.

Consideraciones técnicas

El tipo de microscopía que seráutilizada para el análisis de inmunomarcajes determina, en parte, la viabilidad en el uso de diferentes marcadores. La microscopía de campo claro tiene las ventajas de ser de muy fácil implementación y que además la mayoría de los investigadores pueden disponer del equipo necesario con bastante facilidad. Además, la inmunomarcación en tejidos procesados para microscopía de campo claro es relativamente estable y no se pierde durante la recogida de datos. Sin embargo, la microscopía de campo claro tieneuna resolución óptica limitada en comparación con otros métodos de microscopía y no proporciona una distinción visual clara entre el marcaje en un mismo plano y otro que se superpone. Por tanto, resulta crítico que los marcadores se localicen en diferentes regiones de la célula al realizar marcaciones múltiples usando esta metodología.

En términos generales, una marcado múltiple con marcadores inmunohistoquímicos se logra mejor utilizando la microscopía de fluorescencia. Además de permitir la identificación de los distintos marcadores en el plano XY, este tipo de microscopía también permite la generación de imágenes de capas secuenciales para verificar la colocalización de los marcadores en el plano YZ (Figura 5). El principal inconveniente asociado al marcaje fluorescente es que no es permanente. La observación prolongada del tejido causa fotoblanqueo y el desvanecimiento de la fluorescencia. De igual manera, el escaneado confocal causa fotoblanqueo con cada pasada por lo que solo se pueden hacer un número limitado de escaneos al mismo campo. Por suerte, con la última generación de fluorocromos, esto es un problema menos grave. De hecho, un gran número de anticuerpos para marcadores neuronales se encuentran disponibles conjugados a fluorocromos muy robustos como el Alexa 488 y el Alexa 555.

Marcadores celulares neuronales  Figura 5
Figura 5. Imágenes confocales de células con marcación doble de tubulina ßIII (rojo) y nestina (verde) en el cerebro adulto de rata. Reproducido de la figura 6A de [80].

Otra consideración experimental importante es la forma en que se ha preservado el tejido experimental y cómo se ha procesado para su análisis. Algunos anticuerpos producirán un marcado más efectivo dependiendo de si el tejido ha sido embebido en parafina o no y del tipo de fijador químico que se ha utilizado para su preservación. Los proveedores a veces ofrecen una variedad de anticuerpos contra el mismo antígeno que varían en su compatibilidad con diferentes protocolos. Además, se pueden emplear un diversas estrategias para mejorar la relación señal/ruido, incluyendo el uso de suero para bloquear la unión no específica o peróxido de hidrógeno para desactivar las peroxidasas endógenas. En tejidos fijados con formalina u otros aldehídos las proteínas se entrecruzan de tal manera que los lugares antigénicos se enmascaran, causando una inmunomarcado débil o nulo. Las técnicas de desenmascarado que rompen estos entrecruzamientos pueden realizarse utilizando ácido clorhídrico o fórmico, calor, enzimas proteolíticas (proteinasa K, tripsina, pepsina, pronasa, proteasa), o detergentes (SDS, Triton X).

Si bien tener en cuenta los factores mencionados puede ayudar al realizar los protocolos de inmunomarcado, no evita la necesidad de comprobar la especificidad del anticuerpo bajo las condiciones particulares de un determinado estudio. Una estrategia posible para esto es la de comparar los datos del inmunomarcaje con aquellos obtenidos por histoquímica de la hibridación in situ del ARNm de la proteína diana. El fin de este enfoque estaría limitado a verificar que ambas moléculas se encuentran en la misma célula dado que el ARNm se encuentra presente en el cuerpo celular pero la proteína diana puede estar en cualquier otra parte de la célula. Alternativamente se puede validar la especificidad del anticuerpo utilizando los patrones de marcaje de diferentes anticuerpos que reconocen distintos epítopos de la misma proteína. Sin embargo, la forma más correcta de demostrar la especificidad del anticuerpo sería mostrando la falta de marcaje en un animal que fue modificado genéticamente para eliminar la expresión del gen que produce el antígeno en cuestión (en todo el animal o en un tejido en particular).

Con el aumento del número de anticuerpos comercialmente disponibles con el paso de los años, los investigadores han podido prescindir de tener que generar y validar sus propios anticuerpos. Sin embargo, hay que tener en cuenta que los anticuerpos tendrán una reacción cruzada con antígenos diferentes del objetivocuando se usen a una concentración elevada o en muestras que contengan mezclas complejas de proteínas (como es característico del cerebro). Finalmente, sin importar cuán ampliamente utilizado o cuán bien caracterizado esté un anticuerpo, su validación es responsabilidad de cada investigador.

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