Inhibidores del proteosoma
Mary Johnson (mary at labome dot com)
Synatom Research, Princeton, New Jersey, United States
Translator
Agustin Carbajal (quiocarbajal at gmail dot com)
Cordoba, Argentina
DOI
//dx.doi.org/10.13070/mm.es.2.133
Date
fecha : 2016-09-18; original version : 2012-10-25
Cite as
MATER METHODS es 2012;2:133
Resumen

Resumen breve sobre inhibidores del proteosoma utilizados en investigación, y resultados de revisión bibliográfica.

English Abstract

A succinct review of proteasome inhibitors used in proteasome research, and survey result from the literature.

Proteosoma y sus inhibidores

El proteosoma constituye la mayor vía de degradación por la cual se proteolisan proteínas mal plegadas durante su síntesis y otras proteínas. Se encuentra presente en todas las células eucariotas, en arqueas y en algunas bacterias. Es una proteasa multicatalítica, compuesta de múltiples proteínas catalíticas y regulatorias. Posee tres o cuatro actividades peptidasa diferentes, incluyendo tripsínica, quimiotripsínica e hidrolizante de péptidos peptidilglutamil. La mayoría de las proteínas son ubiquitinadas previo a su degradación proteosómica. Se estima que alrededor del 20 % de los proteosomas 26S participan de la degradación de proteínas en ausencia de estrés proteotóxico [1].

Inhibidores del proteosoma Figura 1
Figura 1. Representación esquemática del sistema proteosomal. La figura es de NIAAA, NIH.

Los inhibidores del proteosoma han encontrado un lugar como drogas terapéuticas contra enfermedades como el cáncer, y una amplia aplicación en la investigación de laboratorio. Bortezomib, también llamado PS-341, Velcade, y MG-341, es una droga aprobada por la FDA para el tratamiento del mieloma múltiple y el linfoma de células de manto. También se utiliza en experimentos de laboratorio para inhibir la actividad del proteosoma [2]. Muchos otros inhibidores del proteosoma se proponen como drogas útiles o se encuentran en fase de evaluación y pruebas clínicas, incluyendo Disulfiram, Epigallocatechin-3-gallate, Salinosporamide A, carfilzomib, ONX 0912, CEP-18770, y MLN9708. GNF6702 inhibe el proteosoma en cinetoplástidos (mientras que no posee actividad contra el proteosoma de mamíferos) [3].

inhibidornúm
MG132 27
lactacistina6
inhibidor del proteosoma I2
Tabla 1. Inhibidores del proteosoma y el número de publicaciones que los citan.

Labome revisó 10422 artículos en búsqueda de aplicaciones de anticuerpos, hasta el 3 de Agosto del 2014. Entre esos 10422 artículos (leer cómo selecciona Labome los artículos), Labome revisó la aplicación de todos los reactivos (incluyendo anticuerpos) en 2348publicaciones. Treinta y cinco de esos 2348 artículos contenían una referencia explícita al uso de inhibidores del proteosoma. La Tabla 1 lista el número de publicaciones para los principales inhibidores del proteosoma. MG132 es la elección predominante citada entre los artículos. Las principales características de estos tres inhibidores del proteosoma se listan en la Tabla 2.

inhibidormecanismoaplicaciónalmacenadonota
MG132reversible~10uM, 1 h-20 °Cmenos costoso <150 USD/5 mg, también inhibe la activación de NF-kB (IC50 = 3 uM) y calpaína
lactacistinairreversible~10 uM, 2 hs-20 °Ccostoso, también inhibe la activación de NF-kB, más específico para la actividad del proteosoma que el MG132
inhibidor del proteosoma Ireversible-20 °C
Tabla 2. Principales características de los inhibidores del proteosoma, concentración para tratamiento y almacenado, en investigación en laboratorio
MG132

MG132, también llamado carbobenzoxi-L-leucil-L-leucil-L-leucinal, Z-LLL-CHO, es un péptido aldehído, uno de un grupo de químicos capaces de inhibir diferentes tipos de proteasas, incluyendo proteasas de serina, calpaínas, etc. Se ha demostrado que MG132 y otros péptidos aldehído inhiben fuertemente las actividades de los proteosomas, y también la de calpaína [4].

Algunas de las aplicaciones del MG132 en las publicaciones revisadas por Labome se encuentran tabuladas en la Tabla 3, junto con sus referencias. Las publicaciones citan el uso de concentraciones de 1, 10, 25, 50 uM con períodos de tratamiento desde uno a varios días.

tipo celulartratamientoreferencia
células 293T, EFM192A10 uM, 1 hora [5]
células de A. polyphaga, células HEK2930.1 uM, 1 h previo a la infección y mantenido en el tiempo [2]
células A43110 uM [6]
células COS-7, HeLa20 uM, 24 h [7]
células COS-725 uM, 5 h [8]
células H1299, U2OS, HeLa10 uM, 12 horas [9]
células HeLa20 mM(?), 24 hrs [10]
células HEK29325 uM, 4 horas [11]
células HEK2931 uM, 16 horas [12]
células HEK-293T50 uM, 4 a 7 horas [13]
Tabla 3. Aplicaciones del MG132 (tiempo de tratamiento y concentración) de la muestra en literatura.

El proteosoma es un parte integral de la función celular. El MG132 y otros inhibidores del proteosoma son tóxicos para las células y los tejidos, y en altas concentraciones o luego de tratamientos prolongados causarán la muerte celular. Es aconsejable titular la concentración óptima en un rango significativo (por ejemplo, 1000x). La concentración óptima depende no solo del tipo celular, sino también de parámetros del cultivo celular como la confluencia celular, la concentración del suero y la composición del medio.

El MG132 debe ser almacenado a -20 °C, y disuelto en DMSO (10 mg/ml) o metanol (1 mg/ml), y alicuotado y almacenado a -20 o -80 °C. Si la solución de MG132 produce un precipitado cuando se añade al medio de cultivo, la solución de stock en DMSO debe ser calentada a 40 °C.

Varios proveedores suministraron MG132 en las publicaciones revisadas por Labome. EMD Millipore (número de catálogo 474790), con las marcas Calbiochem, EMD Biosciences, y Merck, es uno de los mayores proveedores de MG132 entre las publicaciones.

El MG132 de EMD Millipore / Merck / Calbiochem fue utilizado para estudiar el rol de quinasas activadas por mitógeno y de NFkappaB en células monocíticas humanas [14], la interacción entre desmosomas en banda mediados por cadherina y la vía de señalización de Wnt [6], el mecanismo de acción del A20 en la inhibición de la vía de señalización de NF-kappaB [15], la asociación entre el canal de agua AQP1 y la deposición del péptido beta amiloide en cerebros con enfermedad de Alzheimer [16], la señalización por BMP en cáncer de colon [17], la vía de degradación de IkapaBalfa [18], la regulación de la estabilidad de DNMT1 en células de mamífero [7], los roles de RanBP2 y SENP3 en la regulación de la sumoilación de Borealin [19], la autoubiquitinación de cIAP1 inducida por antagonistas [5], los roles de quinasas de proteínas activadas por mitógeno y NFkappaB en la inducción de CD40 por LPS en células monocíticas humanas [14], y la intersección entre desmosomas en banda mediados por cadherina y la vía de señalización de Wnt [6], y la transición de oocito a embrión en Drosophila [20].

El MG132 de Boston Biochem (ahora R & D System) fue utilizado como inhibidor del proteosoma para estudiar la expresión de COMMD1 [21].

El MG132 de BIOMOL (ahora Enzo Life Sciences, número de catálogo BML-PI102-0005) se utilizó para estudiar los roles de la ligasa de ubiquitina regulada por hierro en la homeostasis del hierro [11].

Inhibidores del proteosoma Figura 2
Figura 2. Estructura química del MG132.

El inhibidor del proteosoma MG132 de Sigma fue utilizado en muchos estudios [9, 10, 12, 22-26]. Biovision [2], Peptide Institute [8], y VWR International [13] también fueron citados. El MG132 de Cayman Chemical fue utilizado para tratar esferoides sexuales para demostrar que el gen MID es crítico para el desarrollo del esperma y del huevo de V. carteri [27].

Lactacistina

La lactacistina es un antibiótico, aislado de Streptomyces y ahora puede ser sintetizado químicamente. Se hidroliza en células e in vivo en clasto-lactacistina beta-lactona, que es probablemente el inhibidor activo que modifica covalentemente la treonina N terminal de la subunidad X del proteosoma 20S de mamíferos. La unión covalente es altamente específica y por ende no afecta proteasas de serina o cisteína, comportándose de manera más específica que aldehídos de péptidos como el MG132.

Inhibidores del proteosoma Figura 3
Figura 3. Estructura química de la lactacistina.

La lactacistina ha sido utilizada a concentraciones 10 uM, 25 uM por horas en cultivos celulares.

tipo celulartratamientoreferencia
BxPC-310 uM, 12, 24, 48 hrs [28]
células HEK-293T25 uM 4 a 7 horas [13]
células RAW 264.710 uM, 2 h [29]
Tabla 4. Aplicaciones de lactacistina (tiempo de tratamiento y concentración) de la muestra en literatura.

La lactacistina de EMD Millipore / Merck / Calbiochem se utilizó para estudiar el efecto de la toxina de edema de Bacillus anthracis en la glucógeno sintetasa quinasa nuclear 3beta [29], y para investigar la regulación de la ubiquitinación y degradación de LRRK2 [30].

La clasto-lactacistina beta-lactona de BIOMOL (ahora Enzo Life Sciences) clasto-lactacystin beta-lactone se utilizó para estudiar el rol de “función de activación 1” en la regulación de la movilidad nuclear dependiente del proteosoma y el reclutamiento de la ligasa de ubiquitina asociada a E6 al receptor de estrógeno beta [12].

Las lactacistinas de Bio-Connect [13] y Sigma [22, 28] también fueron citadas.

Inhibidor del proteosoma I

El inhibidor del proteosoma I (IPI) de Calbiochem se utilizó para incubar células transfectadas [31], y el inhibidor del proteosoma I de Peptide Institute (N-carbobenzoxi-L-isoleucil-L-gamma-t-butil-L-glutamil-L-alanil-L-leucinal) se utilizó para tratar las células [32].

Otros inhibidores del proteosoma
PS-341, MG-341, Velcade

Velcade, (sinónimos: PS-341, MG-341), se utilizó en experimentos de laboratorio para inhibir el proteosoma [2]. La toxicidad celular de Velcade fue examinada. Células HEK-293 tratadas con Velcade 50 umol/L por 8 horas no tuvieron pérdida celular significativa. Incubación prolongada (24 horas) con Velcade 0.5 a 50 umol/L causó alrededor de un 40 % de muerte celular [22]. El PS-341 de Biovision se utilizó 0.1 uM para estudiar la degradación proteosomal causada por Legionella pneumophila [2].

XAV 939

La ribosilación dependiente de ADP de PI31 por la ADP ribosil transferasa tankirasela (del inglés, TNKS) inhibe la represión de 20S por PI31 y por ende promueve la actividad proteosomal de 26S. XAV939, una molécula pequeña inhibidora de TNKS, puede bloquear la ribosilación de PI31 dependiente de ADP. El XAV939 de Sigma se utilizó para investigar el rol de Etv2 en el desarrollo vascular [33] y el XAV939 de Cellagen se utilizó para investigar el mecanismo regulatorio de las propiedades de célula madre de células epiteliales de mama de ratón durante el desarrollo [34].

Verificación de la inhibición del proteosoma

Un tema importante en el uso de inhibidores del proteosoma es asegurarse de que de hecho se ha atenuado la actividad proteosómica. Varias técnicas pueden ser utilizadas para verificar la inhibición. Una forma simple es utilizar Suc-LLVY-AMC (N-succinil-L-leucil-L-leucil-L-leucil-7-amido-4-metilcoumarina), como un indicador fluorescente de actividad proteosómica [35]. Otra forma es examinar la relación entre los niveles de mono y poli-ubiquitinas a través de Western blot. Debiera haber un nivel menor de monoubiquitina si la actividad proteosomal se encuentra inhibida.

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ISSN : 2329-5139