Purificación de proteínas
Caroline Ritchie (caroline dot ritchie103 at gmail dot com)
Iowa State University, United States
Translator
Agustin Carbajal (quiocarbajal at gmail dot com)
Cordoba, Argentina
DOI
http://dx.doi.org/10.13070/mm.es.2.134
Date
fecha : 2016-08-22; original version : 2012-11-17
Cite as
MATER METHODS es 2012;2:134
Resumen

Revisión exhaustiva sobre cromatografía en columna para la purificación de proteínas.

English Abstract

An in-depth review of column chromatography for protein purification and survey result from 305 formal publications.

En muchas aplicaciones experimentales es necesario disponer de proteínas purificadas, incluyendo estudios estructurales y ensayos bioquímicos in vitro. Las proteínas pueden ser obtenidas de tejidos o, más comúnmente, sobreexpresándolas en algún organismo modelo como pueden ser las bacterias, las levaduras o las células de mamífero en cultivo. La purificación de proteínas implica aislarlas a partir de su fuente en base a diferencias en sus propiedades físicas. El objetivo de un esquema de purificación es retener la mayor cantidad de proteína funcional con el menor número de contaminantes. El esquema de purificación de una proteína debe ser optimizado para completar el proceso en el menor número de pasos posible.

Purificación de proteínas
 Figura 1
Figura 1. Una solución búfer de Tris contiene la base Tris y su ácido conjugado. El pKa del Tris a 25 °C es 8.06, lo que indica que a pH = 8.06, el 50% del Tris se encontrará protonado (en su forma ácida) y el 50% desprotonado (en su forma básica).

Este artículo revisa cuatro tipos de cromatografía en columna comúnmente usados para purificar proteínas, y discute las ventajas, desventajas y potenciales problemas de cada una. En este artículo también se reporta una revisión de 98 publicaciones hecha por Labome. La revisión indica que la cromatografía por afinidad, principalmente basada en las etiquetas moleculares HIS, GST, y FLAG, y la cromatografía de exclusión molecular son los principales métodos citados en la bibliografía. GE Healthcare es el mayor proveedor de reactivos e instrumentos usados en la purificación de proteínas.

Desarrollo del esquema de purificación de una proteína

La consideración más importante en el desarrollo de un esquema para purificar una proteína son las aplicaciones que se pretenden dar a esa proteína. Tanto la cantidad como la calidad de la proteína deben ser suficientes para el análisis experimental. Además, se debe tener en cuenta información acerca del comportamiento de la proteína, ya que se requiere del correcto plegamiento de la proteína para poder estudiarla. Durante la purificación, y subsiguiente almacenamiento de la proteína, pueden ocurrir muchos procesos que afecten su calidad: desnaturalización, agregación, degradación y pérdida de función. Un planeamiento cuidadoso que permita purificar la proteína tan rápido como sea posible y bajo las condiciones que más promuevan la estabilidad de la proteína maximizará las chances de realizar una purificación exitosa.

Purificación de proteínas
 Figura 2
Figura 2. Un sistema Aktaprime Plus para la separación cromatográfica automática de proteínas. De GE.
Componente búfer

Las condiciones de la solución en la que se encuentra la proteína a lo largo de cada paso de purificación son esenciales para mantener la función y estabilidad de la proteína. Las proteínas deben mantenerse en soluciones con alta capacidad búfer para evitar cambios repentinos de pH que puedan afectar de manera irreversible su plegamiento, solubilidad y función.

Un búfer es una solución que contiene un par conjugado ácido/base. El rango de pH de un búfer está dado por su pKa, definido como el pH en el cual el 50% de las moléculas se encuentran en su forma ácida y el otro 50% en su forma básica (Figura 1). Una regla general para las soluciones búferes es que el pH de la solución debe estar en un rango de más menos una unidad de pH respecto de su pKa para tener buena capacidad búfer. Esto asegura que haya suficientes moléculas tanto en su forma ácida como en su forma básica como para neutralizar el posible influjo de moléculas de H+ u OH-. Así, los búferes previenen cambios de pH que podrían afectar negativamente la estabilidad de la proteína.

Purificación de proteínas
 Figura 3
Figura 3. Ligando Ni-NTA unido covalentemente a una matriz de agarosa entrecruzada para la purificación selectiva de proteínas etiquetadas con polihistidina. Los residuos de histidina pueden coordinar con el ión Ni2+ reemplazando a las moléculas de agua unidas (indicadas con flechas rojas). Luego se puede utilizar imidazol o histidina para eluir la proteína, gracias a su capacidad para coordinar con el ión Ni2+ y desplazar a la proteína unida. De BioKe.

Un buen búfer debe tener las siguientes características [1] :

  1. Solubilidad acuosa
  2. Estabilidad química
  3. Alta capacidad búfer en el pH deseado
  4. Compatibilidad con las aplicaciones analíticas y experimentales
  5. Compatibilidad con otros componentes de la solución

Muchos compuestos pueden servir de búferes biológicos. Aquellos utilizados más comúnmente tienen un pKa casi neutral, ya que pueden ser utilizados a pH fisiológico. En la Tabla 1 se listan cuatro de los búferes más comunes junto con los rangos de pH en los cuales pueden ser utilizados, y las ventajas y desventajas que pueden determinar su uso en la purificación de proteínas. Típicamente, estos búferes se utilizan a concentraciones por encima de 25 mM para asegurar una capacidad búfer adecuada.

BúferRango de pHVentajas y desventajas
Fosfato5.8-8.0
  • El pH no depende de la temperatura
  • Económico
  • Transparente en el rango UV
  • No puede ser utilizado con cationes divalentes
MOPS6.5-7.9
  • No puede ser autoclavado
  • El pH es levemente dependiente de la temperatura
  • Alta capacidad búfer a pH fisiológico
HEPES 6.8-8.2
  • No puede ser autoclavado
  • El pH es levemente dependiente de la temperatura
  • Puede formar radicales libres en ciertas condiciones [2]
Tris7.5-9.0
  • El pH es dependiente de la temperatura y la dilución
  • Económico
  • Puede interferir con la actividad de algunas enzimas [3], [4]
  • Transparente en el rango UV
Tabla 1. búferes biológicos más utilizados en la purificación de proteínas. Los búferes mantienen su capacidad búfer dentro de un rango específico de pH, y algunas características de los componentes del búfer podrían interferir con algunos procedimientos cromatográficos o analíticos. Resumido de Promega, Sigma-Aldrich, Applichem, Embl.de.
Aditivos de solución

Las soluciones utilizadas durante la purificación de proteínas, desde el lisado hasta el almacenamiento, además de contener un sistema búfer apropiado, generalmente también contienen muchos otros componentes que juegan algún rol relacionado a la pureza, estabilidad y función de la proteína.

En el búfer de lisis, y en los primeros pasos de la purificación, generalmente se agregan inhibidores de proteasas para prevenir la degradación de la proteína de interés por acción de proteasas endógenas. Más adelante en el proceso de purificación, estos inhibidores no suelen ser necesarios ya que la mayoría de las proteasas contaminantes han sido separadas de la proteína de interés. Los reactivos quelantes de metales, tales como el EDTA o el EGTA, se suelen agregar al búfer de almacenamiento. Estos quelantes de metales se unen al Mg2+ y, por ende, previenen la degradación de la proteína purificada por metaloproteasas contaminantes. Otros aditivos suelen ser utilizados para proteger las proteínas del daño y para aumentar su solubilidad.

TypeFunciónReactivos comúnmente utilizados
Agentes reductoresProtegen contra el daño oxidativo
  • 2-mercaptoetanol (BME)
  • Ditiotreitol (DTT)
  • Tris (2-carboxietil) fosfino (TCEP)
Inhibidores de proteasasInhibir la actividad catalítica de proteasas endógenas
  • Leupeptina (inhibidor de serina y cisteína proteasas)
  • Pepstatina A (inhibidor de ácido aspártico proteasas)
  • PMSF (inhibidor de serina proteasas)
Quelantes de metalInactivar metaloproteasas
OsmolitosEstabilizar la estructura de la proteína y aumentar su solubilidad
Estabilizantes iónicosAumentar la solubilidadSales (por ej., NaCl, KCl, (NH4)2SO4
Tabla 2. Aditivos comúnmente usados en los búferes de purificación de proteínas para aumentar la estabilidad de las proteínas. Resumido de Thermo Fisher Pierce y Embl.de.

Los aditivos deben ser utilizados solo en caso de ser necesario. Frecuentemente se requiere de un proceso de prueba y error para determinar cuáles aditivos en particular son beneficiosos para el esquema de purificación de una determinada proteína.

Otros factores a considerar

Otros factores también contribuyen a la estabilidad proteica durante el proceso de purificación. Mientras menos se manipule la proteína durante su purificación, mejor. Diseñar un esquema de purificación que utilice la mínima cantidad de pasos en el menor tiempo posible asegura una recuperación máxima de proteína funcional. También es aconsejable, en general, mantener la proteína en frío a lo largo de la purificación. Típicamente la purificación se realiza a 4 °C, ya que esta temperatura disminuye la tasa de proteólisis (en el caso de que haya proteasas contaminantes) y promueve la integridad estructural de las proteínas .

Introducción a la cromatografía en columna
Equipamiento para cromatografías en columna

El principio de la cromatografía en columna es separar un gran grupo de proteínas en muchos grupos menores, algunos de los cuales se encuentran enriquecidos en la proteína de interés. Si bien se encuentran disponibles equipos caros y especializados para realizar cromatografías en columna, solamente se requiere de un equipo básico.

Purificación de proteínas
 Figura 4
Figura 4. Esquema de purificación de afinidad usando la proteína A, G o L. Los anticuerpos contienen varias regiones de interés: el fragmento Fc (fragmento constante), el cual es el mismo para todas los anticuerpos de la misma clase, el fragmento Fv (fragmento variable) el cual confiere especificidad a cada anticuerpo y el fragmento Fab (fragmento de unión a antígeno) el cual contacta con el antígeno específico. B. Tipos específicos de anticuerpos pueden ser purificados de manera no selectiva a través de la purificación por afinidad, en la cual el ligando (proteína A, G o L) es conjugado a la matriz. C. Las proteínas A, G o L también pueden ser utilizadas para purificar proteínas específicas. En este caso, el anticuerpo serviría como un ligando intermedio proveyendo selectividad para su antígeno.

Equipo básico para la cromatografía en columna:

  1. Fase estacionaria: una matriz inerte utilizada para separar proteínas, a menudo con un grupo funcional unido para facilitar la interacción con la proteína. La elección de la fase estacionaria y del grupo funcional depende tanto del tipo de cromatografía que se realiza, como del método por el que se llevará a cabo.
  2. Columna: reservorio cilíndrico de vidrio disponible en varias alturas y diámetros. Las columnas pueden ser compradas preempacadas, con una fase estacionaria lista para ser acoplada a cromatógrafos automáticos (discutido en la parte 2 de esta sección), o pueden ser compradas vacías para empacarlas manualmente. Diferentes tipos de columnas son requeridas según se trate de cromatografías automatizadas o de flujo impulsado por gravedad.
  3. Solventes: búferes con aditivos, utilizados para equilibrar, lavar y eluir proteínas de la fase estacionaria. Diferentes tipos de cromatografías requieren de diferentes condiciones de solvente.
  4. Tubos de recolección: recipientes para recolectar las fracciones de elución; sin embargo, cualquier tubo o recipiente es apto si la recolección es manual.
  5. Ensayo para medir la pureza: ensayo para determinar la cantidad de relativa de una proteína en particular respecto de las proteínas totales en una muestra. Luego de cada paso es necesario determinar cuál es la fracción que contiene la proteína de interés, antes de proceder al paso siguiente en el esquema de purificación. Algunos métodos frecuentes de análisis de pureza serán discutidos en una sección posterior.
Sistemas para cromatografía en columna

La cromatografía en columna puede ser realizada utilizando sistemas automáticos (Figura 2), los cuales utilizan una bomba para forzar el paso del solvente a través de una columna empaquetada, a una velocidad de flujo determinada; o puede ser corrida utilizando la fuerza de la gravedad. Ambos sistemas, por bomba o por gravedad, pueden ser acoplados a un sistema automático de recolección de muestras. Cada sistema tiene ventajas y desventajas. El sistema de FPLC AKTA de GE Healthcare es una elección muy común [5-10].

Tipo de sistemaVentajasDesventajas
Automatizado
  • Se puede dejar corriendo solo
  • Generalmente acoplado a un detector de absorbancia
  • Se pueden programar los pasos de equilibración y lavado
  • Facilidad para realizar un gradiente de elución
  • Alta reproducibilidad
  • Requiere de equipamiento específico y costoso
  • Máxima velocidad de flujo depende del límite de presión que soporta la columna
Flujo por gravedad
  • Más económico
  • El usuario tiene mayor control
  • Se pueden realizar ajustes durante la corrida
  • Más laborioso
  • La velocidad de flujo está limitada por la gravedad
Tabla 3. Sistemas para la separación cromatográfica de proteínas GE.
Tipos de cromatografía en columna

Los cuatro tipos de cromatografía en columna más importantes incluyen la cromatografía por afinidad, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de fase reversa y la cromatografía de exclusión molecular. La mayoría de los esquemas de purificación requieren el uso de más de uno de estos procedimientos cromatográficos para poder alcanzar la pureza necesaria para las subsiguientes aplicaciones. Escoger los métodos cromatográficos apropiados y el orden de estos es esencial para optimizar el proceso de purificación.

Tipo de cromatografíaSepara las proteínas segúnSe une enEluye con
De afinidadUna interacción específicaAusencia del ligando competidorLigando competidor (específico); condiciones que impiden las interacciones proteína/proteína (no específico)
De intercambio iónicoCarga neta superficialBaja fuerza iónicaAlta fuerza iónica; pH alto (intercambio catiónico) o pH bajo (intercambio aniónico)
De fase reversaHidrofobicidadAlta fuerza iónicaBaja fuerza iónica
De exclusión molecularRadio hidrodinámico
Tabla 4. Los cuatro tipos de cromatografía en columna más utilizados en la purificación de proteínas.

Analizando la secuencia de la proteína se pueden identificar características únicas que pueden ayudar en su purificación. Se pueden determinar el tamaño y carga de la proteína (a un pH dado), así como una larga sucesión de residuos hidrofóbicos

Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad se basa en la unión específica y reversible de una proteína a un ligando unido a la matriz. El ligando puede unirse de manera directa a la proteína de interés o a una etiqueta molecular que se encuentre ligada a la proteína. La cromatografía de afinidad es, en general, la técnica de purificación más robusta y típicamente se utiliza en los pasos tempranos del esquema de purificación. La purificación por cromatografía de afinidad puede ser el único paso requerido para lograr un grado de pureza adecuado, dependiendo de la aplicación que se le quiera dar a la proteína.

Purificación de proteínas
 Figura 5
Figura 5. La carga neta de una proteína está influenciada por el pH del solvente. En un pH = pI la proteína tendrá carga neta nula y, por ende, no se unirá a una fase estacionaria de intercambio catiónico o aniónico. Ajustar el pH por encima o por debajo del pI de la proteína otorgará a la proteína una carga neta y esta se unirá a una fase estacionaria de intercambio aniónico (pH>pI) o catiónico (pH<pI).

La fase estacionaria para la cromatografía de afinidad está constituida por una matriz inerte unida covalentemente a un ligando que se une específicamente a una proteína o a un grupo de proteínas. La matriz inerte típicamente está compuesta por agarosa o poliacrilamida entrecruzada. Las proteínas pueden ser purificadas por cromatografía de afinidad de manera selectiva o no selectiva. En una cromatografía de afinidad selectiva se usa un ligando específico para una proteína o para una etiqueta molecular unida covalentemente a la misma. En una cromatografía de afinidad no selectiva el ligando se une a un grupo de proteínas con capacidad de unión similar, tal como es el caso de la proteína A, G o L para las inmunoglobulinas; la heparina para las proteínas de unión a ADN; o las lectinas para las glucoproteínas.

En ambos tipos de cromatografía las proteínas se siembran sobre una columna bajo condiciones que promueven la unión entre la proteína (o la etiqueta) y su ligando. La proteína unida es lavada en condiciones que rompen las interacciones no específicas entre las proteínas contaminantes y la matriz, pero no así las específicas entre la proteína de interés y el ligando. La proteína unida luego es eluida utilizando un búfer que contiene una molécula que compite con la proteína o en condiciones que rompen todas las interacciones proteína/proteína. La molécula que compite con la proteína se une al ligando, desplazando la proteína de interés. Esta molécula luego es removida de la proteína de interés ya sea a través de otra cromatografía o con diálisis. Los métodos para eluir las proteínas de la fase estacionaria rompiendo todas las interacciones proteína/proteína incluyen un cambio de pH o de fuerza iónica del búfer. Estos métodos pueden afectar la estabilidad de la proteína y se sugiere que la proteína eluida sea neutralizada inmediatamente o diluida para minimizar el daño. Para algunas variantes de la cromatografía de afinidad se han descripto condiciones de elución particulares para maximizar la cantidad de proteína funcional recuperada [11, 12].

Proteína a purificarLigandoEluye con
Anticuerpo (específico de antígeno)Péptido antigénicoPéptido libre
Proteína etiquetada con polihistidinaNi2+ o Co2+Imidazol o histidina libre
Proteína etiquetada con FLAGAnticuerpo específico para FLAGPéptido FLAG o pH bajo
Proteína etiquetada con GSTGlutatión reducidoGlutatión libre
Proteína etiquetada con MycAnticuerpo específico para MycpH bajo
Anticuerpo (tipo específico)Proteína A , G, o LpH extremo
Proteína de unión a ADNHeparinaAlta fuerza iónica
Tabla 5. Ejemplos de formas selectivas y no selectivas de cromatografía de afinidad con el grupo (ligando) usado para otorgarle especificidad y condiciones típicas de elución. Resumido de Thermo Fisher Pierce y GE. Ver abajo los distribuidores usuales para los diferentes tipos de columnas según la revisión bibliográfica de Labome de más de 200 publicaciones.

En el diseño de un plásmido para expresar una proteína se puede agregar una etiqueta de afinidad tanto del lado N como C terminal (o en casos poco frecuentes, cuando se conoce la estructura de la proteína, en bucles flexibles de la misma) para facilitar la purificación. Ver la revisión bibliográfica de Labome sobre Etiquetas para proteínas para una lista de etiquetas y discusiones relacionadas.

Los anticuerpos suelen ser purificados en base a la interacción altamente específica que ocurre entre un anticuerpo y su antígeno (la secuencia reconocida por el anticuerpo). Un péptido conteniendo el antígeno puede ser acoplado a la matriz para así unir el anticuerpo de manera específica. La disminución del pH del búfer de elución rompe la interacción anticuerpo/péptido y libera el anticuerpo. Este método es utilizado comúnmente para la purificación comercial de anticuerpos a partir de suero.

Purificación de proteínas
 Figura 6
Figura 6. Cromatografía de intercambio iónico. Las proteínas se encuentran unidas a una fase estacionaria cargada en un búfer de baja fuerza iónica. Las proteínas unidas pueden ser eluidas incrementando la fuerza iónica del búfer o ajustando el pH.

Las proteínas también pueden ser purificadas por afinidad de una manera no selectiva. En una purificación no selectiva el ligando, unido a la fase estacionaria, se une a un grupo de proteínas las cuales se asocian a moléculas similares. Un ejemplo de purificación por afinidad no selectiva es la purificación de proteínas de unión a ADN. La heparina imita al DNA, tanto en estructura como en carga, y puede ser utilizada como ligando para la purificación de proteínas de unión a ADN. Mientras que todas las proteínas de unión a ADN podrán, en teoría, unirse a la fase estacionaria, la mayoría del resto de las proteínas pasarán sin unirse, permitiendo así un enriquecimiento de la proteína de interés. Otro ejemplo es el enriquecimiento de anticuerpos a través de la unión de su región constante (Fc) al ligando proteína A, G o L. Las columnas de afinidad de proteína A de GE Healthcare son una elección común [13-15], así como lo son las de proteína G [16].

Utilizando un modo de unión similar (un anticuerpo unido al ligando proteína A, G o L), la región del anticuerpo de unión al antígeno (Fab) todavía se encuentra disponible para unirse a su antígeno específico. Así, proteínas específicas pueden ser purificadas en base a la interacción específica entre el ligando y el anticuerpo y el anticuerpo y el antígeno.

Los problemas más comunes y sus soluciones se listan en la Tabla 6.

ProblemaCausaSolución
La proteína no se uneLa etiqueta no se tradujo o no se encuentra accesibleRevisar la secuencia del plásmido o ubicar la etiqueta en otro lugar
Las condiciones de unión no son las apropiadasAjustar las condiciones del búfer
No se dio suficiente tiempo para permitir la uniónDisminuir la velocidad de flujo o detenerlo para permitir la incubación
La proteína no eluyeLa afinidad entre el ligando y la etiqueta es demasiado altaAumentar la concentración del competidor (específica) o disminuir la permisividad de las condiciones de unión (no específica)
La proteína se agregó en la columnaAjustar las condiciones del búfer para una mayor estabilidad proteica
Baja resoluciónLa velocidad de flujo es o muy alta o muy bajaAjustar la velocidad de flujo
La columna no se lavó lo suficienteLavar con un búfer menos permisivo; limpiar la fase estacionaria de acuerdo a las instrucciones del fabricante
La proteína se agregó en la columnaAjustar las condiciones del búfer para una mayor estabilidad proteica
Las condiciones de elución son demasiado permisivasAumentar la concentración del competidor (específica) o ajustar las condiciones (no específica)
La proteína pierde actividad durante el procedimientoLa proteína está desnaturalizada o agregadaAjustar las condiciones para una mayor estabilidad proteica
Un cofactor necesario para la actividad fue removido durante la purificaciónAgregar el cofactor
Tabla 6. Resolución de problemas relacionados a la cromatografía de afinidad. Resumido de GE.
Cromatografía de intercambio iónico (CII)

La cromatografía de intercambio iónico separa las proteínas en función de su carga neta de superficie, a través de interacciones electrostáticas que ocurren entre las proteínas y la fase estacionaria cargada. Existen dos tipos de CII: (1) intercambio aniónico (fase estacionaria cargada positivamente que une proteínas cargadas positivamente); y (2) de intercambio catiónico (fase estacionaria cargada positivamente que une proteínas cargadas negativamente). La cromatografía de intercambio iónico se usa comúnmente como un paso intermedio en un esquema de purificación de proteínas; sin embargo, puede otorgar una gran resolución para algunas proteínas cuando se utiliza en pasos tempranos o tardíos durante la purificación.

Todas las proteínas exhiben una carga neta que depende de la composición aminoacídica de la proteína y de sus modificaciones postraduccionales covalentes. Debido a que las proteínas intercambian iones hidrógeno con el solvente, la carga neta de una proteína está influenciada por el pH del solvente en se encuentra disuelta. El punto isoeléctrico (pI) de una proteína es el pH en el cual la proteína no tiene carga neta. A un pH mayor al pI, la proteína tendrá carga neta negativa, mientras que a un pH menor al pI la proteína tendrá caga neta positiva. Por ende, el pH del solvente puede ser ajustado para facilitar la unión de la proteína a la fase estacionaria o para promover la elución de la proteína unida.

Purificación de proteínas
 Figura 7
Figura 7. Cromatografía de fase reversa. En alta fuerza iónica, las proteínas se encuentran parcialmente desolvatadas, lo que causa que adopten una conformación alternativa en la cual los residuos hidrofóbicos que normalmente se encuentran fuera del alcance del solvente ahora se encuentren más expuestos. Estos residuos pueden formar interacciones hidrofóbicas con los grupos funcionales hidrofóbicos conjugados a la matriz. Una disminución de la fuerza iónica permite que la proteína adopte nuevamente su configuración nativa, ocultando sus residuos hidrofóbicos. Esto disminuye las interacciones hidrofóbicas entre la proteína y la fase estacionaria, facilitando la elución de la proteína.

En teoría, todas las proteínas pueden unirse a columnas de intercambio tanto catiónico como aniónico si el pH del búfer se ajusta adecuadamente. Sin embargo, para la purificación de proteínas, la estabilidad de la proteína es la consideración de mayor importancia al elegir las condiciones de purificación y por ende la columna más adecuada para unir la proteína. Por lo tanto, es necesario determinar si las condiciones requeridas para la unión a una u otra forma de cromatografía de intercambio iónico afectarán la estabilidad y función de la proteína. Típicamente, las condiciones de unión para una proteína en particular a uno de los tipos de cromatografía intercambio iónico son más adecuadas que las de la otra.

Conocer el punto isoeléctrico de una proteína puede ayudar a determinar el tipo de cromatografía de intercambio iónico más apropiado. Hay herramientas en línea disponibles para calcular el pI de una proteína EXPASY. Estos cálculos se basan enteramente en la secuencia aminoacídica de la proteína y no contemplan la estructura tridimensional de la misma. En su estado nativo, algunos residuos de la proteína se encuentran más expuestos que otros y, por ende, el pI real y la carga neta de superficie a veces son diferentes de aquellos determinados teóricamente [17]. La distribución de aminoácidos también puede afectar el pI de una proteína [18], lo cual no es tenido en cuenta en los cálculos teóricos de pI. Algunas técnicas permiten la determinación experimental del pI de una proteína en su estado nativo, incluyendo la electroforesis de isoelectroenfoque [19], isoelectroenfoque capilar [20] y, más recientemente, una técnica de alta capacidad de procesamiento de abordaje fluorescente [21].

Típicamente, la unión de una proteína a una columna de CII debe ser determinada por prueba y error, utilizando solventes en un rango de valores de pH para determinar el pH óptimo para la retención de la proteína. Un pH con una unidad de pH de diferencia con el pI suele ser suficiente para la unión de la proteína [22] ; sin embargo, en algunos casos se requiere un pH más alejado del pI [23].

La fase estacionaria de la CII está compuesta por una matriz polimérica de agarosa a la cual se encuentran unidos covalentemente grupos cargados. Las partículas de la matriz están disponibles en muchos tamaños y pueden ser o no porosas, con poros de diferentes tamaños. La elección de la matriz depende de la capacidad de unión, resolución y velocidad de flujo deseadas. Partículas más pequeñas ofrecen una mayor resolución pero requieren de velocidades de flujo menores y por ende las corridas toman más tiempo. Las matrices porosas ofrecen una mayor capacidad de unión que aquellas no porosas. En una matriz no porosa las proteínas no pueden entrar en la resina y, por ende, permiten una mayor recuperación de muestra, mayor resolución y tiempos de corrida menores que las matrices porosas. Un estudio demostró que, para la mayoría de las proteínas, la resolución y la recuperación son similares cuando son separadas utilizando una matriz porosa o no porosa; sin embargo, para las proteínas de mayor tamaño, las matrices porosas pueden perder capacidad de resolución debido a efectos de exclusión molecular [24].

Purificación de proteínas
 Figura 8
Figura 8. Proteína eluida de una columna de fase reversa con un gradiente decreciente de sal (sulfato de amonio). En cada fracción se analizó tanto el contenido total de proteínas así como la actividad específica de la proteína de interés. El pico centrado en la fracción 45 contiene la proteína de interés, tal como indica la actividad de la proteína. De http://www.insectscience.org/9.04/ .

Los cuatro grupos funcionales con carga más comúnmente usados en las CII se muestran abajo. Estos se clasifican como intercambiadores fuertes o débiles, los fuertes encontrándose ionizados en un rango de pH mayor que los débiles.

Intercambio aniónico (fase estacionaria cargada positivamente):

  1. amonio cuaternario(Q) - Intercambiador aniónico fuerte
  2. dietilaminoetil (DEAE) - intercambiador aniónico débil

Intercambio catiónico (fase estacionaria cargada negativamente):

  1. sulfonato de metilo (S) - intercambiador catiónico fuerte
  2. carboximetil (CM) - intercambiador catiónico débil

Intercambiadores fuertes deben ser usados cuando el pH requerido para la unión es muy ácido o muy básico (asumiendo que este pH también es apropiado para mantener la estabilidad de la proteína), ya que los grupos funcionales permanecen cargados en un rango amplio de pH, [25]. Se ha demostrado que los intercambiadores débiles proveen menor retención de algunas proteínas, permitiendo su elución a fuerzas iónicas menores [26]. Debido a que una alta fuerza iónica puede afectar la estabilidad de algunas proteínas [27], los intercambiadores débiles pueden ser más apropiados para proteínas que no requieren de un pH extremo para unirse.

En la cromatografía de intercambio iónico, la fase estacionaria primero es equilibrada con un búfer de baja fuerza iónica. La muestra proteica luego es sembrada sobre la fase estacionaria en el mismo búfer de baja fuerza iónica utilizado durante la equilibración. La proteína unida se lava abundantemente previo a su elución con un búfer de alta fuerza iónica o, en algunos casos, un búfer de diferente pH (Figura 6). Los contraiones en el búfer de elución interactúan con la fase estacionaria cargada, desplazando a la proteína unida. Algunas sales son más eficientes que otras en las cromatografías de intercambio aniónico, gracias a su habilidad para desplazar proteínas unidas y a su efecto sobre la estabilidad proteica [28]. Típicamente se usa NaCl o KCl para la elución, sirviendo el Na+ o el K+ de contracatión en la cromatografía de intercambio catiónico y el Cl- de contranión en la cromatografía de intercambio aniónico. Alternativamente se puede alterar el pH del búfer para reducir la carga de la proteína y así romper la interacción con la fase estacionaria. Para proteínas unidas a una fase estacionaria catiónica, un aumento el pH del búfer disminuirá las cargas positivas de la proteína y la eluirá de la columna. Para proteínas unidas a una fase estacionaria de intercambio aniónico, una disminución del pH del búfer disminuirá las cargas negativas de la proteína y la eluirá de la columna.

Purificación de proteínas
 Figura 9
Figura 9. Una mezcla de tres proteínas de diferente radio hidrodinámico es sembrada sobre una columna de exclusión molecular. Las proteínas de mayor tamaño eluyen primero ya que no pueden penetrar en los poros de la matriz y tienen un camino directo a través de la columna. Las proteínas más pequeñas pueden penetrar en los poros, por lo que tienen un camino más serpentino y, por ende, les lleva más tiempo atravesar la matriz y eluir de la columna.

Alternativamente, el pH del búfer se puede ajustar de tal manera que la proteína de interés no se una a la fase estacionaria mientras que las proteínas contaminantes sí. En ese caso, la proteína de interés se recoge en la fracción que pasa, mientras que algunas de las proteínas contaminantes son removidas a través de su unión a la fase estacionaria.

Tal como con otras técnicas cromatográficas, la cromatografía de intercambio iónico puede requerir de una puesta a punto para determinar las condiciones óptimas para la unión y elución de la proteína y una adecuada resolución.

ProblemaCausaSolución
La proteína no se uneLa columna no estaba equilibradaPasar más búfer de equilibración por la columna y cargar nuevamente la proteína
La fuerza iónica del búfer de unión es muy altaDisminuir la fuerza iónica del búfer
El pH no es suficientemente diferente al pIAjustar el pH (disminuirlo para intercambio catiónico, aumentarlo para intercambio aniónico)
La proteína no eluyeLa fuerza iónica del búfer de elución es muy bajaIncrementar la fuerza iónica
La proteína se agregó en la columnaAjustar las condiciones del búfer para favorecer la estabilidad proteica
Baja resoluciónLa velocidad de flujo es o muy baja o muy altaAjustar la velocidad de flujo
La columna no fue lavada lo suficienteLavar con un búfer de mayor fuerza iónica, limpiar la fase estacionaria de acuerdo a las instrucciones del fabricante
La proteína se agregó en la columnaAjustar las condiciones del búfer para favorecer la estabilidad proteica
La proteína pierde actividad durante el procesoLa proteína se encuentra desplegada o agregadaAjustar las condiciones del búfer para favorecer la estabilidad proteica
Un cofactor necesario para la actividad fue removido durante la purificaciónAgregar el cofactor
Tabla 7. Resolución de problemas relacionados a la cromatografía de intercambio iónico. Resumido de GE.
Cromatografía de fase reversa (CFR)

La cromatografía de fase reversa (CFR) separa las proteínas en base a su hidrofobicidad y, generalmente, se utiliza en un paso intermedio del esquema de purificación. Las proteínas se encuentran unidas a una fase estacionaria en un búfer de alta fuerza iónica y, por ende, la CFR puede ser realizada inmediatamente después de la cromatografía de intercambio iónico sin dilución o cambio de búfer de por medio. La CFR también se suele realizar luego de una precipitación con sulfato de amonio, un procedimiento utilizado para remover de manera rápida las proteínas mediante la precipitación de algunas proteínas con sal. La CFR a veces se puede aplicar en fases tempranas del proceso de purificación o bien en el paso final para la remover impurezas presentes en pequeñas cantidades.

La presencia de iones provenientes de sales puede llevar a la desnaturalización parcial de una proteína y a la consiguiente exposición de residuos hidrofóbicos, los cuales generalmente se encuentran enterrados dentro de la proteína. A medida que se agrega un búfer con menor fuerza iónica las proteínas que se encuentran unidas a la fase estacionaria adoptan su configuración nativa. Esto disminuye la exposición de los residuos hidrofóbicos que pueden interaccionar con la fase estacionaria y facilita la elución de la proteína. Para proteínas que pueden renaturalizarse espontáneamente a partir de una disminución de la fuerza iónica, la CFR puede ser un método valioso para su purificación.

Típicamente, se debe utilizar un búfer de unión con la fuerza iónica más baja que permita la unión de la proteína de interés, al mismo tiempo que impide su precipitación. Si la fuerza iónica requerida para que se una la proteína es alta y causa su precipitación, se puede utilizar una fuerza iónica menor. En este caso, el procedimiento cromatográfico puede ser utilizado para separar todas las proteínas que se unen de la proteína de interés, la cual pasa sin unirse.

Previo a la siembra de la proteína en la columna, la fase estacionaria debe equilibrarse con el búfer de alta fuerza iónica (el mismo en el que se sembrará la proteína). Hecho esto, la muestra se siembra sobre la columna, la columna se lava abundantemente y la proteína se eluye con un búfer de baja fuerza iónica (Figuras 7 y 8).

La fase estacionaria utilizada en la cromatografía de fase reversa está compuesta de una matriz base de agarosa entrecruzada, o de un copolímero sintético. A esa base se le conjuga un ligando alquilo o arilo, el cual le provee especificidad para moléculas hidrofóbicas.

Tipos de grupos funcionales:

  1. Alquilo - cadena hidrocarbonada de longitud variable; generalmente se utiliza un grupo butilo u octilo. La capacidad de unión de la fase estacionaria aumenta con la longitud de la cadena carbonada del grupo alquilo [29]. Los grupos funcionales unen proteínas basados enteramente en la hidrofobicidad de la proteína
  2. Arilo - grupo funcional derivado de un anillo aromático; generalmente un grupo fenilo. Los grupos arilos ofrecen mayor especificidad ya que las proteínas también pueden interaccionar con el grupo funcional a través de interacciones de apilamiento.

El tipo y la concentración de la sal utilizada para la unión y la elución deben ser determinadas empíricamente para cada proteína. Adicionalmente, se debe asegurar el replegamiento y la función de la proteína luego de la elución.

Tal como con otras formas de cromatografía en columna, un procedimiento de CFR óptimo requiere de una puesta a punto importante. Es necesario ajustar, para cada proteína, las condiciones del búfer y de la fase estacionaria para asegurar una separación óptima.

ProblemaCausaSolución
La proteína no se uneLa columna no fue equilibradaPasar más búfer de equilibración por la columna y sembrar nuevamente la proteína
La fuerza iónica del búfer de unión es muy bajaAumentar la fuerza iónica del búfer
La proteína se agregó con la fuerza iónica utilizadaDisminuir la fuerza iónica del búfer o probar una sal diferente
La proteína no eluyeLa fuerza iónica del búfer de elución es muy altaDisminuir la fuerza iónica
La proteína se agregó en la columnaAjustar las condiciones del búfer para favorecer la estabilidad proteica
La retención es muy altaProbar una fase estacionaria que ofrezca una retención menor
Baja resoluciónLa velocidad de flujo es o muy rápida o muy lentaAjustar la velocidad de flujo
No se lavó la columna lo suficienteLavar con un búfer de fuerza iónica menor; limpiar la fase estacionaria de acuerdo a las instrucciones del fabricante
La proteína se agregó en la columnaAjustar las condiciones del búfer para favorecer la estabilidad proteica
Poca retención en la columnaProbar una fase estacionaria diferente que ofrezca una menor retención
La proteína pierde actividad durante el procedimientoLa proteína se encuentra desnaturalizada o agregadaAjustar las condiciones del búfer para favorecer la estabilidad proteica
La proteína no recuperó su conformación nativaProbar unir la proteína utilizando una sal diferente o a una menor fuerza iónica; incluir aditivos para una mayor estabilidad proteica
Durante la purificación se removió un cofactor necesario para la actividad de la proteínaAgregar el cofactor
Tabla 8. Resolución de problemas relacionados a la cromatografía de fase reversa. Resumido de GE.
Cromatografía de exclusión molecular (CEM)

La cromatografía de exclusión molecular separa las proteínas en función de su radio hidrodinámico, una propiedad determinada tanto por el tamaño como por la forma de la molécula. A diferencia del resto de los procedimientos cromatográficos descriptos previamente, las proteínas no se unen a la fase estacionaria en la CEM. En cambio, las proteínas se separan por la velocidad a la cual navegan a través de la fase estacionaria inerte (Figura 9).

La CEM es un método valioso utilizado, generalmente, en el paso final del esquema de purificación, gracias a su habilidad de separar las diferentes especies de una proteína. Especies oligoméricas [30], moléculas de proteínas desplegadas [31], y especies truncadas [32] pueden ser separadas de la proteína nativa al mismo tiempo que se cambian los componentes del búfer. A menudo, la CEM se utiliza como un método más veloz y más confiable que la diálisis, ya que es compatible con una gama de solventes más amplia y además requiere de menos búfer. Un único solvente es utilizado a lo largo de todo el proceso de CEM y las fases estacionarias comerciales disponibles son compatibles con la mayoría de los componentes de los búferes más utilizados.

Tanto el tipo de fase estacionaria utilizada como el largo de la columna juegan un papel crítico con respecto a la resolución de las proteínas separadas por CEM. Varios tipos de fases estacionarias se encuentran disponibles a nivel comercial, y la mejor opción depende tanto del peso molecular de las proteínas que requieren separación como de las condiciones en las cuales se realizará la separación.

Tipo de fase estacionariaMatrizCaracterísticas
SefadexDextrano y epoclorhidrina entrecruzados
  • Ofrece rápido cambio de búfer y separación de grupos
  • Funciona bien para determinar el peso molecular
  • Autoclavable
  • La matriz puede llegar a achicarse con algunos solventes
  • Se encuentran disponibles diferentes tipos de sefadex para el uso de solventes orgánicos
SefacrilAlil dextrano y N-N-metilen bisacrilamida entrecruzados
  • Separa moléculas en un rango amplio de pesos moleculares
  • Autoclavable
  • Funciona con solventes acuosos y orgánicos
  • Recuperación alta
SefarosaAgarosa entrecruzada
  • Separa moléculas en un rango amplio de pesos moleculares
  • Recuperación alta
  • No puede ser autoclavada
SuperosaAgarosaa altamente entrecruzada
  • Funciona con solventes acuosos y orgánicos
  • Autoclavable
  • Es posible que haya interacciones hidrofóbicas entre la matriz y las proteínas
  • Compatible con solventes viscosos
SuperdexAgarosa y dextrano entrecruzados
  • Funciona con solventes acuosos y orgánicos
  • Autoclavable
  • Resolución alta
  • Recuperación alta
Tabla 9. Tipos de fases estacionarias comerciales disponibles para cromatografías de exclusión molecular y características de cada una. Resumido de GE y Sigma Aldrich.

Superdex es en general la mejor opción para CEM típicas, ya que es compatible con la mayoría de los solventes y ofrece la mejor resolución de todas las fases estacionarias disponibles.

Al igual que con otros métodos cromatográficos, la CEM tiene ventajas y desventajas, y la decisión de utilizar este método depende tanto de la proteína como de la aplicación que se le pretende dar a la misma.

Ventajas de la CEM:

  1. Permiten el intercambio de búfer y la desalación.
  2. Permite la separación de especies similares (por ej. especies truncadas y oligómeros) que pueden no ser separables mediante otras técnicas de purificación.
  3. Es compatible con muchos solventes.
  4. No depende de ninguna propiedad específica de la proteína para su retención y elución.

Desventajas de la CEM:

  1. Su rendimiento es muy sensible al empaque de la columna.
  2. Puede haber interacciones no específicas entre la proteína y la resina, lo que disminuye la resolución.
  3. Baja resolución para mezclas complejas de proteínas.
  4. La muestra debe ser sembrada en un volumen pequeño para obtener una resolución adecuada. Esto puede ser problemático para proteínas que precipitan en altas concentraciones.
Optimizar las condiciones de la CEM para alcanzar una máxima resolución a menudo puede ser laborioso, pero algunos factores pueden tener un impacto enorme sobre la resolución.

Condiciones que aumentan la resolución de la CEM:

  1. Minimizar el volumen de muestra. Mientras menor sea el volumen, menos difusas serán las fracciones eluidas.
  2. Agregar sal al búfer. Una pequeña cantidad de sal ayuda a prevenir las interacciones no específicas entre la proteína y la fase estacionaria.
  3. Utilizar una velocidad de flujo moderada. Una corrida muy rápida no permitirá a las moléculas pequeñas entrar en los poros, mientras que una corrida muy lenta le dará más tiempo a la muestra para difundir.
  4. Asegurarse que la viscosidad del solvente y la muestra sean similares. Ajustar las condiciones de la muestra de tal manera que se asemejen a aquellas del búfer de corrida.
  5. Ajustar el largo de la columna. Una columna muy corta no permite una separación adecuada de las proteínas. Por otro lado, una columna muy larga lleva a la difusión de la muestra proteica.
  6. Reempaque la columna. El empaque de la columna puede tener efectos enormes sobre la resolución de proteínas

Si las partículas no se encuentran bien dispersas, o si hay burbujas de aire atrapadas en la columna, la navegación a través de la fase estacionaria no ocurrirá de manera adecuada. Además, si se dejó secar la columna se la debe reempacar. Un mal empaque es, en general, el culpable de una inexplicable baja resolución.

Debido a que la CEM no separa a las proteínas en base a su interacción con grupos funcionales, todas las proteínas eluyen bajo las mismas condiciones y, por ende, solo se pueden resolver proteínas de radio dinámico muy diferente. Por lo tanto, la CEM no es una técnica cromatográfica apropiada para etapas iniciales del esquema de purificación cuando hay muchas proteínas contaminantes. La CEM si ofrece, sin embargo, una forma confiable y rápida de remover sales y pequeñas moléculas de una muestra en los pasos iniciales o intermedios de la purificación. En las etapas finales de la purificación, cuando solo existen contaminantes en muy baja concentración, la CEM es un método valioso para el aislamiento de la proteína y su pasaje al búfer de almacenamiento.

Elución y análisis de la proteína
Métodos de elución de proteínas

Las proteínas que se unen a la fase estacionaria son eluidas con condiciones de solvente que rompen esas interacciones. Estas condiciones de elución varían tanto con el tipo de cromatografía como con las propiedades de la proteína de interés. Existen tres métodos generales para la elución de proteínas: elución en grupo, elución por partes y elución en gradiente lineal. El mejor método a elegir depende del tipo de cromatografía que se está haciendo y de la resolución requerida.

  1. En grupo - una sola condición de elución desplaza a todas las proteínas unidas en un solo paso. Este mecanismo funciona mejor para procedimientos cromatográficos basados en una interacción específica (por ej. la cromatografía de afinidad). La elución en grupo no ofrece ninguna resolución, pero es ideal para eliminar los contaminantes de manera rápida. Requiere de un conocimiento previo de las condiciones de búfer necesarias para desplazar la proteína de interés.
  2. En pasos - se realizan múltiples eluciones en grupo de manera secuencial, con condiciones menos permisivas en cada caso. En la elución en pasos, el número de fracciones colectadas depende del número de condiciones de eluciones secuenciales. La elución en pasos provee mejor resolución que la elución en grupo, pero peor resolución que la elución en gradiente lineal.
  3. Gradiente lineal - múltiples fracciones consecutivas son recolectadas mientras se ajustan las condiciones de elución de manera lineal. Un gradiente lineal ofrece la mayor resolución para las cromatografías de intercambio iónico y de fase reversa. Típicamente se recolectan un gran número de fracciones consecutivas.

La cromatografía de exclusión molecular no requiere de ninguno de estos métodos de elución, ya que las proteínas no interaccionan con la fase estacionaria. La proteína se siembra en la columna y un gran número de fracciones se recolecta hasta que todas las proteínas hayan eluido, sin alterar las condiciones del búfer a lo largo del procedimiento.

Idealmente, el búfer de elución de una columna es compatible con la columna que le sigue, eliminando la necesidad de intercambiar búferes o de dializar entre los diferentes pasos de purificación.

Análisis de la pureza de las fracciones

Luego de cada separación cromatográfica se deben analizar las fracciones para determinar cuáles de ellas contienen la proteína de interés, y además la pureza de esas fracciones. Este análisis es necesario luego de cada paso para decidir qué fracciones deben ser combinadas para su uso posterior. Para determinar la pureza se requiere un ensayo que pueda medir la cantidad de una proteína específica relativa a la cantidad de proteínas totales. Los siguientes ensayos son utilizados de rutina para el análisis de pureza:

  1. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE, por su sigla en inglés) - un gel desnaturalizante que separa las proteínas en función de su tamaño. Tinciones disponibles comercialmente permiten obtener una representación visual de todas las proteínas en la muestra, permitiendo realizar una valoración cualitativa de la pureza proteica (Figura 10). EL SDS-PAGE no es ideal para el análisis de una alta cantidad de fracciones y puede llevar varias horas; sin embargo, es el utilizado con mayor frecuencia debido a que es fácil, económico y funciona para cualquier proteína.

    Purificación de proteínas
 Figura 10
    Figura 10. SDS-PAGE de muestras recolectadas durante la purificación de una proteína. El gel se tiñó para visualizar todas las proteínas. De http://www.omicsonline.org/ .
  2. Espectroscopía - un método para analizar las propiedades ópticas de las proteínas. Esta técnica para analizar la pureza de las proteínas solo sirve para proteínas que tienen una característica espectroscópica única, tal como el citocromo P450s. Las proteínas de esta familia absorben luz a una longitud de onda a la que otras proteínas no [33] ), por ende, una comparación entre la absorbancia a 420 nm y a 280 nm (la longitud de onda a la que absorben todas las proteínas) puede proveer una medida cuantitativa de la pureza de la proteína. Este método es rápido y apto para procesar una alta cantidad de muestras.
  3. Actividad de la proteína - una prueba enzimática que depende de la proteína de interés. Este método para evaluar la pureza proteica es, a menudo, acoplado a otro método de determinación de concentración de proteínas para calcular la actividad en función de la concentración total de proteínas. Los ensayos de actividad solo son aptos para proteínas con actividad que puede ser fácilmente determinada utilizando un ensayo de alta capacidad de procesamiento, tal como las proteasas. Para algunas proteínas los ensayos de actividad son un método rápido y confiable para la detección de la proteína. La medición de actividad es, a menudo, ideal para enzimas, ya que las proteínas que han perdido actividad pueden ser excluidas de los pasos siguientes.
Almacenamiento de la proteína purificada

Una vez que se obtuvo la proteína con una pureza suficiente como para ser utilizada en estudios experimentales, la misma debe ser almacenada de manera apropiada. La elección de un búfer de almacenamiento final es tan importante como la elección de los búferes utilizados durante la purificación. Esta elección debe basarse en la estabilidad de la proteína y de las condiciones requeridas para su posterior aplicación. A menudo, la cromatografía de exclusión molecular es elegida como el paso final en el esquema de purificación, ya que el búfer final de almacenamiento puede ser intercambiado efectivamente en este paso cromatográfico. Las fracciones puras pueden ser combinadas para su inmediato almacenamiento. Alternativamente, las fracciones finales que fueron combinadas pueden ser dializadas en el búfer seleccionado, previo a su almacenamiento.

Las condiciones de almacenamiento de la proteína dependen de la proteína de interés y deben ser optimizadas de manera tal que la proteína mantenga su estabilidad estructural y funcional a lo largo de períodos de tiempo prolongados. A menudo se incluyen aditivos en el búfer de almacenamiento para prolongar el tiempo de vida de las proteínas purificadas, y generalmente se requiere de un proceso de prueba y error para determinar las condiciones óptimas, ya que cada proteína se comporta de manera particular.

Revisión bibliográfica de citas de purificación de proteínas hecha por Labome

Labome revisó 305 publicaciones al azar que citan métodos de purificación de proteínas. En la Tabla 10 se listan los principales proveedores y métodos de purificación. Los métodos de exclusión molecular y de afinidad son los más citados en la literatura. GE Healthcare es el mayor proveedor para todos los métodos y Qiagen es el proveedor más significativo de métodos de purificación de proteínas basados en la etiqueta HIS, y Sigma Aldrich de aquellos basados en la etiqueta FLAG.

typeproveedormarca principalnúmreferencia
de afinidad
HISQiagenAgarosa Ni-NTA52 [7, 14, 34-82]
GE HealthcareSefarosa Ni, HisTrap FF/HP20 [6, 63, 78, 83-99]
Clontechafinidad por metal TALON14 [6, 100-112]
BD Biosciencesresina de afinidad por meta TALON5 [113-117]
Sigma-Aldrichagarosa Ni-NTA5 [9, 118-121]
GST
GE Healthcaresefarosa 4B glutatión53 [9, 10, 38-40, 44, 45, 52, 54, 57, 66, 75, 76, 78, 81, 82, 93, 98, 106, 113, 115, 122-153]
Sigma-Aldrichagarosa glutatión3 [69, 154, 155]
EMD Milliporeesferas con glutatión2 [156, 157]
FLAGSigma-Aldrichafinidad para FLAG M219 [52, 88, 134, 158-169]
Otros métodos de purificación por afinidad citados incluyen a Jacalina unida a agarosa para glucoproteínas de unión O-glucosídica, de Vector Laboratories [110], la resina de amilosa de New England Biolabs para la etiqueta de proteínas de unión a maltosa [69, 109, 170], la matriz de afinidad de unión a proteína C, de Roche [88], sistemas basados en estreptabiotina de Thermo Fisher Pierce [109, 171-173], de EMD Millipore [174, 175], de Qiagen [96], de IBA [51], y de Sigma-Aldrich [171], la resina de inmunoafinidad de Myc de Sigma-Aldrich [167], la sefarosa quelante de alta velocidad de flujo para proteínas de unión a metales, de GE Healthcare [176] y la columna HiTrap IMAC HP de GE Healthcare [177], columnas de heparina de GE Life Sciences [10, 176, 178, 179], proteína A HiTrap de GE Healthcare Life Sciences [14], sefarosa IgG de GE Healthcare [180], sefarosa 4B poli(A) de GE Healthcare [10], la resina SulfoLink de Thermo Scientific [181], la resina Affi-Gel 10 de BioRad [181], la agarosa unida a proteína A de RepliGen [181], y la agarosa conjugada a V5 de Sigma V5 [143].
exclusión molecular
SuperdexGE-Healthcare74 [5, 7, 49, 51, 54, 55, 57, 63, 64, 66, 70, 73, 75-78, 82, 84, 87, 91, 92, 94, 96, 97, 102, 105, 106, 111, 117, 121, 125, 137, 166, 176, 177, 179, 182-204]
SuperosaGE Healthcare11 [10, 49, 64, 74, 82, 99, 134, 194, 204-206]
SefarosaGE Healthcare2 [68, 207]
intercambio iónico
aniónicoGE Healthcarecolumna MonoQ5 [58, 70, 98, 194, 208]
GE HealthcareHiTrap Q6 [64, 67, 71, 78, 99, 209]
GE HealthcareSource 15Q2 [69, 105]
GE HealthcareSefarosa Q1 [76]
Whatmanresina de intercambio aniónico DE521 [178]
catiónicoGE HealthcareColumna Mono S3 [49, 76, 96]
de fase reversa
GE healthcarefenil sefarosa CL-4B1 [45]
Sigma-Aldrichfenil sefarosa1 [76]
Tabla 10. Estadísticas de la revisión de Labome sobre 98 publicaciones citando sistemas de purificación de proteínas. Núm: número de publicaciones.

En la literatura revisada, las muestras proteicas fueron preparadas utilizando el reactivo de extracción de proteínas BugBuster de EMD Millipore [187], [175], [210] o el equipo para romper células EmulsiFlex C-3 de AVESTIN [58, 211], y fueron concentrados usando los concentradores Amicon Ultra de EMD Millipore [10, 79, 99, 110, 117, 167, 173, 178, 189], las columnas para centrifuga Sartorius de Thermo Fisher [212] o con concentradores Vivaspin [107, 117, 187, 209].

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