Fraccionamiento subcelular
Parisis Nikos (nnparisis at gmail dot com)
National Institute for Agricultural Research, Montpellier, France
Translator
Agustin Carbajal (quiocarbajal at gmail dot com)
Cordoba, Argentina
DOI
//dx.doi.org/10.13070/mm.es.3.562
Date
fecha : 2016-10-26; original version : 2013-10-31
Cite as
MATER METHODS es 2013;3:562
Resumen

Resumen de métodos de fraccionamiento subcelular.

English Abstract

An overview of subcellular fractionation methods.

La separación de los compartimientos celulares es un paso importante para estudiar una estructura intracelular, proteína u organela específica, o para investigar posibles asociaciones entre estas estructuras macromoleculares. El fraccionamiento subcelular utiliza una o mas propiedades de cada compartimento, tales como la densidad de flotación, densidad de carga superficial, forma y tamaño, y se basa principalmente en la centrifugación diferencial en medios de alta viscosidad a 4°C. Los medios utilizados para la centrifugación diferencial son principalmente sacarosa, manitol, glicerol, Ficoll 400 (un polímero de sacarosa), Percoll (sílica coloidal) y iodixanol (OptiPrep). La sacarosa es ampliamente utilizada porque es económica. Pero todos tienen sus ventajas y limitaciones, las cuales son discutidas en detalle por Harford y Bonifacino, 2011. Principalmente estos métodos serán discutidos aquí, con preferencia a aquellos métodos que son fácilmente accesibles para la mayoría de los laboratorios y que consumen menos tiempo, ya que una recuperación rápida es vital. La cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de afinidad, electroforesis o perturbación selectiva de cambio de densidad también pueden ser utilizados. Variaciones en las condiciones de los protocolos disponibles dependen de las organelas, tejidos o tipos celulares y equipos utilizados, y es altamente recomendable leer las referencias citadas para obtener los detalles completos de cada procedimiento. Al final, la pureza y el rendimiento del fraccionamiento deben ser evaluados mediante la detección de distintos marcadores en cada fracción recolectada durante todo el procedimiento. A continuación se presentan los métodos utilizados mas comúnmente para el aislamiento de organelas. La utilización de hígado de rata ha sido discutida en detalle y puede ser encontrada fácilmente en literatura; por ende el foco de esta parte de este resumen se encuentra en otros sistemas modelo.

Aislamiento de citoplasma, núcleoplasma y cromatina

Fracciones citoplásmicas, nucleoplásmicas y cromatínicas pueden ser preparadas fácilmente a partir de un precipitado de células cultivadas [1]. Las células son resuspendidas en un búfer conteniendo sacarosa 0.34 M, glicerol 10% y baja concentración de un detergente suave (Triton X-100 0,1%) así como K+ y Mg+2 (los cuales evitan que el núcleo se rompa) y los núcleos son precipitados mediante una centrifugación a baja velocidad mientras que el sobrenadante se mantiene como la fracción citoplásmica. A continuación los núcleos son lisados en un búfer conteniendo los agentes quelantes EDTA y EGTA y la fracción insoluble cromatínica es precipitada mediante una centrifugación a baja velocidad mientras que el sobrenadante es la fracción nucleoplásmica [1] (Figura 1).

Fraccionamiento subcelular Figura 1
Figura 1. Representación esquemática del fraccionamiento subcelular a partir de células cultivadas de Mendez y Stillman [1].

Algunos investigadores utilizan una preparación " rápida y sucia" de cromatina con sus proteínas asociadas del citoplasma/nucleoplasma. Esto es realizado simplemente lisando las células en un búfer conteniendo Triton X-100 1%. En este búfer, la cromatina y algunas estructuras citoesqueléticas son insolubles y pueden ser recuperadas por centrifugación. El precipitado puede ser resuspendido en un búfer de elección, por ejemplo búfer Laemmli para SDS-PAGE [2].

Aislamiento de mitocondria por centrifugación diferencial

1. 1. Los precipitados de células, crecidas como monocapa o en suspensión, son homogeneizados en un búfer conteniendo MgCl2 y KCl. Luego, se añade sacarosa hasta 0,25 M y los núcleos son precipitados por centrifugación a baja velocidad (1000 g). Una segunda centrifugación del sobrenadante a 5000 g precipitará las mitocondrias. El precipitado es resuspendido en un medio conteniendo sacarosa y Mg+2 y sometido a algunos ciclos de homogeneización en un homogeneizador de Dounce. Un último paso de centrifugado a 5000 g enriquecerá las mitocondrias las cuales pueden ser resuspendidas en búfer Tris conteniendo sacarosa 0,25 M o en el búfer de preferencia para los análisis subsiguientes (por ej. Laemmli) [3].

2. Las células de levadura son tratadas con zymolasa para romper la dura membrana exterior y producir esferoblastos, los cuales son lavados en búfer con sorbitol. El precipitado es resuspendido en búfer de homogeneización conteniendo manitol 0,6 M y las células son lisadas mediante algunos ciclos de homogeneización en un homogeneizador de Dounce. Los núcleos son removidos mediante centrifugación de baja velocidad, mientras que el sobrenadante conteniendo el citoplasma es centrifugado en un rotor de ángulo fijo a 6500 g para precipitar las mitocondrias.

Adicionalmente, existen protocolos que utilizan separaciones con gradientes de densidad los cuales proveen fracciones mitocondriales mas puras, pero utilizan mas tiempo y son evitadas. A pesar de la "contaminación" por lisosomas y peroxisomas en las fracciones obtenidas por centrifugación diferencial, son el método de elección. Por lo tanto, la pureza deseada determina cuál es el método mas adecuado; alternativamente, si la localización exacta de una proteína se encuentra en estudio o son necesarias muestras en su forma mas pura, por ej. en proteómica, las preparaciones en gradientes de densidad son mas adecuadas.

Aislamiento de peroxisomas

Smith et al [4] utilizaron un sobrenadante posnuclear obtenido mediante una centrifugación a 2.000 g, la cual fue luego recentrifugada a 20.000 g por 20 minutos. El precipitado, el cual contenía mitocondrias y peroxisomas, fue resuspendido en búfer MS (sorbitol 0,65 %, MES 5 mM, pH 5,5) y fue colocado encima de un gradiente de Nycodenz (17%, 25%, 35%, 50%) en búfer MS. Luego de una centrifugación a 116.000 g por 2 h, los peroxisomas se encuentran en las fracciones 2 a 8.

Una mayor separación de las proteínas asociadas a membranas de peroxisomas fue lograda por el método Fujiki (1982) y Nuttley et al 1990, tal como citado en [4]. El precipitado de la centrifugación a 20.000 g previamente mencionada fue resuspendida en 10 volúmenes de búfer Ti8 (Tris 10mM, pH 8.0 y PINS (1 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 2 μg leupeptina/ml, 2 μg aprotinina/ml, y 0.4 μg pepstatina A/ml)) y separada a 200.000 g por 1 h. El precipitado, con las membranas peroxisomales, fue nuevamente resuspendido en búfer Ti8 y con la adición de carbonato de sodio 0,1 M y una subsiguiente centrifugación a 200.000 g por 1 h, las membranas peroxisomales fueron separadas de las proteínas con las que se encontraban asociadas pero no de las proteínas integrales de membrana.

Aislamiento de lisosomas (de líneas celulares cultivadas)

Los lisosomas, mitocondrias y peroxisomas poseen densidades muy similares en gradientes de sacarosa; por ende es preferible evitar a este método. En Percoll, son mas densos y tal método resulta en lisosomas con muy poca o nada de contaminación de otras organelas.

Las células lavadas son homogeneizadas con 5 ciclos en un homogeneizador en 3 ml de búfer conteniendo sacarosa 0,25 M. Una centrifugación de 10 minutos a 800 g precipitará los núcleos intactos y restos celulares y el sobrenadante puede ser almacenado en hielo. El precipitado nuclear puede ser resuspendido en 0,5 ml del mismo búfer, recentrifugado como antes y el sobrenadante se junta con el sobrenadante de la primera centrifugación. En esta solución, la solución de stock de Percoll (conteniendo sacarosa 0,25 %) y albúmina sérica bovina (ASB) son añadidas a una concentración final de 20 % (nota: esto puede ser incrementado a 27- 35 %) y 0,4 % respectivamente (volumen final 4,5 ml), y centrifugado por 30 minutos a 36.000 g (nota: esto puede variar de 15.000 g por 60 min a 62.500 g por 40 min). Utilizando un recolector de gradiente, el gradiente es recolectado en fracciones de 0,4 ml y los lisosomas usualmente se encuentran cerca del fondo del gradiente. Para solubilizar mejor los lisosomas e incrementar la recuperación, se añade NP-40 a una concentración final de 0,5 %, previo al centrifugado a 100.000 g por 1-2 h. Pero si las organelas intactas son de interés, por ej. para ensayos metabólicos, se debe evitar el NP-40 [5].

Aislamiento de melanosomas

Kushimoto et al y Basrur et al Utilizaron un gradiente discontinuo de sacarosa en búfer HEPES [6, 7]. Mas específicamente, el lisado celular fue resuspendido en sacarosa 2 M y colocado encima de un gradiente discontinuo de sacarosa (1.0, 1.2, 1,4; 1,5; 1,.6; 1,8; 2,0 M). Luego de una centrifugación a 100.000 g por 1 h, los melanosomas de estadío temprano (estadío I y II) fueron recuperados en la zona aproximada de sacarosa 1,0-1,2 M. Esta fracción enriquecida fue separada aun mas en una fracción rica en proteínas y una fracción rica en tirosinasa por electroforesis de flujo libre (EFL) en un aparato Octopus-PZE FFE a 2 ml/h. La EFL se llevó a cabo a 1000-1100 V y ≈110-125 mA utilizando sacarosa 0,25 M en trietanolamina, pH 7,4, con una tasa del flujo de elución de 3-4 ml/min [7]. Este procedimiento produjo muestras altamente enriquecidas en melanosomas para análisis de proteómica los cuales identificaron >60 proteínas de melanosoma [6].

Otro protocolo que resulta en fracciones melanosomales de alta pureza fue desarrollado por los mismos investigadores. El lisado celular en sacarosa 2 M fue colocado al fondo de un gradiente discontinuo de sacarosa. Luego de una centrifugación a 100.000 g por 1 h, los melanosomas de estadío temprano, los cuales fueron recuperados en la zona aproximada de sacarosa 1 M fueron colocados posteriormente en el medio de un gradiente extendido de sacarosa 0,8, 1,0, y 1,2 M y centrifugados nuevamente de la misma manera. Este paso adicional removió por completo la "contaminación" de mitocondrias.

Los melanosomas tardíos (estadío III y IV) también fueron recuperados de la capa de sacarosa 1,8 M, ya que contienen una mayor cantidad de melanina y por ende son mas pesados.

Purificación de exosomas

Welton et al han purificado exosomas a partir del medio de cultivo de la línea celular HT1376 [8]. Luego de remover las células mediante una centrifugación suave (400 g por 10 minutos) y los restos celulares (2000 g por 15 minutos y luego 10.000 g por 30 minutos), el sobrenadante fue sometido a centrifugación de alta velocidad (100.000 g por 2 h) colocándolo encima de un colchón de sacarosa en óxido de deuterio (D2O o agua pesada). Luego de lavar con PBS, el precipitado contenía los exosomas.

Hogan et al han aislado exosomas a partir de orina con el siguiente método [9]. La muestra de orina fue limpiada en un primer paso mediante una centrifugación a 15.000 g y pasada a través de un filtro de nylon de 8 μm antes de ser centrifugada nuevamente a 150.000 g por 1 h. El precipitado conteniendo vesículas tipo exosoma y la proteína de Tamm-Horsfall (PTH o uromodulina), la principal proteína en orina. Para remover la PTH, la muestra fue colocada encima de un gradiente discontinuo de sacarosa (5-30 %) en D2O con pH 6.0. Luego de centrifugar a 200.000 g por 24 h, el colchón fue recolectado en 14 fracciones iguales. Cada fracción fue diluida entre 5 y 10 veces en PBS y recentrifugada a 15.000 g por 1 h y los precipitados con los exosomas puros fueron recuperados.

Extracción de histonas

Las histonas son las proteínas mas básicas del ambiente intracelular. Esta es la principal característica utilizada para enriquecer histonas a partir de células o extractos de Xenopus laevis. Resuspendiendo los núcleos intactos y purificados (tal como discutido anteriormente) en ácido sulfúrico 0,2 M (H2SO4), y luego de la incubación con rotación a 4 °C, la mayoría de las proteínas celulares precipitan mientras que las histonas permanecen solubles y son recuperadas por centrifugación a 16.000 g por 15 minutos [10]. Alternativamente, las histonas cromatinizadas pueden ser extraídas por incubación en NaCl 2,5 M.

Purificación de membranas de Golgi (a partir de hígado de ratón)

Un método para el aislamiento de membranas de Golgi fue el utilizado por Chen et al [11]. Un homogenato de tejido de hígado preparado en búfer conteniendo sacarosa 0,5 M fue colocado encima de sacarosa 0,86 M y esto fue cubierto con sacarosa 0,25 M. Luego de una centrifugación a 103.800 g por 60 minutos, las membranas fueron recolectadas en la interfase 0,5-1,3 M y ajustada a sacarosa 0,5 M.

Aislamiento de centrosomas

Los centrosomas pueden ser aislados a partir de células epiteliales adheridas, pero no en grandes cantidades. Andersen et al utilizaron más de 2 mil millones de células (2x109) [12]. Los núcleos son aislados por lisis hipotónica y los centrosomas son recolectados luego de dos pasos de centrifugación. Primero, por centrifugación en un colchón de sacarosa 50 % y subsiguientemente por centrifugación en un gradiente de sacarosa 40 %, 50 % y 70%.

Moritz et al aislaron centrosomas de embriones de drosophila de la siguiente manera: un homogenato (en búfer BRB80 + KCl 100 mM y sacarosa 14 %) de embriones de 3,5 horas fue centrifugado a 1.500 g por 10 minutos y los lípidos fueron removidos. El sobrenadante fue utilizado para aislar los centrosomas luego de la adición de Triton X-100 0,1-0,5 % y sacarosa 50% (concentraciones finales), colocándolo en un gradiente de sacarosa (4 mL de 55 % y 3 mL de 70 %) y centrifugados y centrifugando a 100.000 g por 90 minutos. La mayoría de los centrosomas se acumularon encima del colchón de 70 % [13].

Aislamiento de pseudopodias

Las células migratorias forman una extensión en uno de sus lados, la cual se adherirá a un nuevo sitio y luego tirará el resto del cuerpo celular a este nuevo sitio. Esta extensión es llamada pseudopodio. Klemke y colegas [14] han desarrollado un método para aislar pseudopodios de los cuerpos celulares en respuesta a agentes quimiotácticos. Es todo es logrado utilizando cámaras de migración Transwell ("entre pocillos") en platos de 6 o 24 pocillos. Brevemente, a las células se les permite adherirse al lado superior del filtro el cual posee poros pequeños de 3 micrones. Son lo suficientemente pequeños como para que la célula completa no pueda pasar. Pero los pseudopodios formados pueden pasar y se adherirán al lado inferior del filtro, cuando las células detecten el agente quimiotáctico el cual ha sido colocado en el compartimento inferior. Luego las células son fijadas y los pseudopodios o los cuerpos celulares son recolectados por lisis en el búfer de elección [15].

Fraccionamiento de citosol, núcleos, RE liso y rugoso, membrana plasmática, mitocondrias.

Song et al han realizado fraccionamiento subcelular a partir de hígados de ratón pero este método puede ser utilizado para otros tejidos también, luego de unas modificaciones [16]. Un esquema en la figura 2 resume todo el procedimiento. Brevemente, el homogenato de hígado fue centrifugado a 1.000 g por 10 minutos para separar el precipitado (P1) y la fracción soluble (S1).

Fraccionamiento subcelular Figura 2
Figura 2. Representación esquemática del fraccionamiento subcelular a partir de tejido hepático de ratón de Song et al [16].

El P1 resuspendido en un búfer final conteniendo sacarosa 1,8 M (para las recetas completas de los búferes, se dirige al lector a las publicaciones originales) fue centrifugado a 70.900 g por 90 minutos y dio lugar a un precipitado (P2) con los núcleos de las células hepáticas, los cuales pueden ser almacenados, y una fracción soluble entre la interfase 0,25-1,8 M (S2). S2 fue resuspendida en sacarosa 0,25 M, centrifugada a 1.200 g por 10 minutos, y el precipitado conteniendo las membranas plasmáticas crudas fue resuspendido en un búfer final conteniendo sacarosa 1,45 M y centrifugado a 68.400 g por 60 minutos. La fracción soluble entre sacarosa 0,25 y 1,45 M fue suplementada con un búfer conteniendo sacarosa 0,25 M y recentrifugada a 17.600 g por 10 minutos. El precipitado fue resuspendido en un búfer final conteniendo sacarosa 1,35 M y centrifugado a 230.000 g por 60 minutos. La fracción 0,25-1,35 M fue recuperada, diluida con sacarosa 0,25 M y recentrifugada a 4.000 g. El consiguiente precipitado contenía las proteínas de membrana plasmática y fue almacenado.

La fracción soluble S1 fue recentrifugada a 8.000 g por 15 minutos. Esto produjo una fracción insoluble (P5) la cual contenía mitocondrias crudas y una fracción soluble (S5) conteniendo RE (microsomas livianos y pesados) así como complejo de Golgi.

Luego de lavar, el P5 fue resuspendido en 12 ml de una solución conteniendo Nycodenz 25 % [17] y colocado en un gradiente discontinuo de Nycodenz (5 ml de 34 % y 8 ml de 30 %) y cubierto con 8 ml de 23 % y 3 ml de 20 %. Luego de una centrifugación a 52.000 g por 90 minutos, las mitocondrias fueron recuperadas en la interfase 25-30 %. Esta fracción fue recolectada y diluida en un búfer final el cual resultó en manitol 200 mM y sacarosa 50 mM antes de ser centrifugada a 15.000 g por 20 minutos. El precipitado resultante conteniendo mitocondrias puras fue lavado y almacenado.

La fracción soluble S5 fue centrifugada a 34.000 g por 30 minutos resultando en un precipitado (P6), y una fracción soluble con los microsomas livianos (S4). S4 fue centrifugado a 124.000 g para separar el citosol, el cual fue almacenado, de los microsomas (precipitado). El P6 fue mezclado con los microsomas livianos de la centrifugación previa y diluido en un búfer final conteniendo sacarosa 0,25 M y CsCl 0,015 M. La solución fue colocada sobre una solución de sacarosa 1,3 M y centrifugada a 237.000 g por 2 horas. Esto separó el RE rugoso (precipitado) de RE liso en la interfase 0,25-1,3 M. Esta fracción soluble fue diluida 1:1 con sacarosa 0,25 M y centrifugada a 124.000 g por 60 minutos. El RE liso fue recuperado en el precipitado y almacenado [16].

En el caso de que ninguna literatura haya sido citada, la información sobre la función de las proteínas fue obtenida de la base de datos UniprotKB, de Cell Signaling y de Abcam.

Preguntas frecuentes
¿Cómo aislar cloroplastos a partir de tejidos vegetales?

Suspender el homogenato de tejido vegetal en un medio isotónico (0,35 mol/L de cloruro de sodio o 0,4 mol/L de sacarosa) para minimizar cualquier daño a los cloroplastos. Centrifugue el homogenato a 1000 rpm por 2 minutos para remover residuos de tejido y células remanentes. Luego centrífugue a 3000 rpm por 5 minutos para obtener el precipitado de cloroplastos. La centrifugación debe realizarse a 0~5°C.

¿Pueden las mitocondrias aisladas mantener su actividad y funciones fisiológicas?

Sí. Las fuerzas centrífugas no dañan la estructura mitocondrial. Además, el búfer de centrifugado posee un rol protector sobre las mitocondrias.

¿algún protocolo modificado para el fraccionamiento subcelular de tejido o células musculares?

Se ha publicado un protocolo simple y económico para este propósito [18].

Referencias
  1. Mendez J, Stillman B. Chromatin association of human origin recognition complex, cdc6, and minichromosome maintenance proteins during the cell cycle: assembly of prereplication complexes in late mitosis. Mol Cell Biol. 2000;20:8602-12 pubmed
  2. Lossaint G, Besnard E, Fisher D, Piette J, Dulic V. Chk1 is dispensable for G2 arrest in response to sustained DNA damage when the ATM/p53/p21 pathway is functional. Oncogene. 2011;30:4261-74 pubmed publisher
  3. Attardi G, Ching E. Biogenesis of mitochondrial proteins in HeLa cells. Methods Enzymol. 1979;56:66-79 pubmed
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  7. Kushimoto T, Basrur V, Valencia J, Matsunaga J, Vieira W, Ferrans V, et al. A model for melanosome biogenesis based on the purification and analysis of early melanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98:10698-703 pubmed
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  9. Hogan M, Manganelli L, Woollard J, Masyuk A, Masyuk T, Tammachote R, et al. Characterization of PKD protein-positive exosome-like vesicles. J Am Soc Nephrol. 2009;20:278-88 pubmed publisher
  10. Shechter D, Dormann H, Allis C, Hake S. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2007;2:1445-57 pubmed
  11. Chen X, Andrews P, Wang Y. Quantitative analysis of liver Golgi proteome in the cell cycle. Methods Mol Biol. 2012;909:125-40 pubmed publisher
  12. Andersen J, Wilkinson C, Mayor T, Mortensen P, Nigg E, Mann M. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 2003;426:570-4 pubmed
  13. Moritz M, Braunfeld M, Fung J, Sedat J, Alberts B, Agard D. Three-dimensional structural characterization of centrosomes from early Drosophila embryos. J Cell Biol. 1995;130:1149-59 pubmed
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ISSN : 2329-5139