Fraccionamiento subcelular
Parisis Nikos (nnparisis at gmail dot com)
Institute Jacques Monod, Paris, France
Translator
Agustin Carbajal (quiocarbajal at gmail dot com)
Cordoba, Argentina
DOI
//dx.doi.org/10.13070/mm.es.3.562
Date
fecha : 2018-05-25; original version : 2013-10-31
Cite as
MATER METHODS es 2013;3:562
Resumen

Resumen de métodos de fraccionamiento subcelular.

English Abstract

An overview of subcellular fractionation methods.

La separación de los compartimientos celulares es un paso importante para estudiar una estructura intracelular, proteína u orgánulo específico, o para investigar posibles asociaciones entre estas estructuras macromoleculares. El fraccionamiento subcelular utiliza una o más propiedades de cada compartimento, tales como la densidad de flotación, densidad de carga superficial, forma y tamaño, y se basa principalmente en la centrifugación diferencial en medios de alta viscosidad a 4°C. Los medios utilizados para la centrifugación diferencial son principalmente sacarosa, manitol, glicerol, Ficoll 400 (un polímero de sacarosa), Percoll (sílica coloidal) y iodixanol (OptiPrep). La sacarosa es ampliamente utilizada porque es económica. Pero todos tienen sus ventajas y limitaciones, las cuales son analizadas en detalle por Harford y Bonifacino, 2011. Principalmente estos métodos serán analizados aquí, con preferencia a aquellos métodos que son fácilmente accesibles para la mayoría de los laboratorios y que consumen menos tiempo, ya que una recuperación rápida es vital. La cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de afinidad, electroforesis o perturbación selectiva de cambio de densidad también pueden ser utilizados. Variaciones en las condiciones de los protocolos disponibles dependen de los orgánulos, tejidos o tipos celulares y equipos utilizados, y es altamente recomendable leer las referencias citadas para obtener los detalles completos de cada procedimiento. Al final, la pureza y el rendimiento del fraccionamiento deben ser evaluados mediante la detección de distintos marcadores en cada fracción recolectada durante todo el procedimiento. A continuación, se presentan los métodos utilizados más comúnmente para el aislamiento de orgánulos. La utilización de hígado de rata ha sido analizada en detalle y puede encontrarse fácilmente en la literatura; por tanto, el foco de esta parte de este resumen se encuentra en otros sistemas modelo.

Aislamiento de citoplasma, núcleoplasma y cromatina

Fracciones citoplásmicas, nucleoplásmicas y cromatínicas pueden ser preparadas fácilmente a partir de un precipitado de células cultivadas [1]. Las células son resuspendidas en un tampóntampón que contiene sacarosa 0.34 M, glicerol 10% y baja concentración de un detergente suave (Triton X-100 0,1%) así como K+ y Mg+2 (los cuales evitan que el núcleo se rompa) y los núcleos son precipitados mediante una centrifugación a baja velocidad mientras que el sobrenadante se mantiene como la fracción citoplásmica. A continuación, los núcleos son lisados en un tampóntampón que contiene los agentes quelantes EDTA y EGTA, y la fracción insoluble cromatínica es precipitada mediante una centrifugación a baja velocidad mientras que el sobrenadante es la fracción nucleoplásmica [1] (Figura 1).

Fraccionamiento subcelular Figura 1
Figura 1. Representación esquemática del fraccionamiento subcelular a partir de células cultivadas de Mendez y Stillman [1].

Algunos investigadores utilizan una preparación " rápida y sucia" de cromatina con sus proteínas asociadas del citoplasma/nucleoplasma. Esto se consigue simplemente lisando las células en un tampóntampón que contiene Triton X-100 al 1%. En este tampónbuffer, la cromatina y algunas estructuras citoesqueléticas son insolubles y pueden recuperarse por centrifugación. El precipitado puede resuspenderse en el tampóntampón de elección, por ejemplo, tampónLaemmli buffer para SDS-PAGE [2].

Aislamiento de mitocondria por centrifugación diferencial

Los precipitados de células, crecidas como monocapa o en suspensión, son homogeneizados en un tampóntampón que contiene MgCl2 y KCl. Luego, se añade sacarosa hasta 0,25 M y los núcleos se precipitan por centrifugación a baja velocidad (1000 g). Una segunda centrifugación del sobrenadante a 5000 g precipitará las mitocondrias. El precipitado se resuspende en un medio conteniendo sacarosa y Mg+2 y sometido a algunos ciclos de homogeneización en un homogeneizador de Dounce. Un último paso de centrifugado a 5000 g enriquecerá las mitocondrias, las cuales pueden resuspenderse en tampóntampón Tris con sacarosa 0,25 M o en el tampóntampónde preferencia para los análisis subsiguientes (por ej. Laemmli) [3].

Las células de levadura son tratadas con zymolasa para romper la dura membrana exterior y producir esferoblastos, los cuales son lavados en tampónun tampón con sorbitol. El precipitado se resuspende en tampóntampón de homogeneización con manitol al 0,6 M y las células son lisadas mediante algunos ciclos de homogeneización en un homogeneizador de Dounce. Los núcleos son eliminados mediante centrifugación de baja velocidad, mientras que el sobrenadante que contiene el citoplasma es centrifugado en un rotor de ángulo fijo a 6500 g para precipitar las mitocondrias.

Además, existen protocolos que utilizan separaciones con gradientes de densidad que proporcionan fracciones mitocondriales más puras, pero requieren más tiempo y se suelen evitar. A pesar de la "contaminación" por lisosomas y peroxisomas en las fracciones obtenidas mediante centrifugación diferencial, éste sigue siendo el método de elección. Por lo tanto, la pureza deseada determina cuál es el método más adecuado; alternativamente, si la localización exacta de una proteína se encuentra en estudio o son necesarias muestras en su forma más pura, por ej. en proteómica, las preparaciones en gradientes de densidad resultan más adecuadas.

Aislamiento de peroxisomas

Smith et al [4] utilizaron un sobrenadante posnuclear obtenido mediante una centrifugación a 2.000 g, que fue luego recentrifugada a 20.000 g por 20 minutos. El precipitado, que contenía mitocondrias y peroxisomas, fue resuspendido en tampóntampón MS (sorbitol 0,65 %, MES 5 mM, pH 5,5) y fue colocado encima de un gradiente de Nycodenz (17%, 25%, 35%, 50%) en tampóntamón MS. Tras una centrifugación a 116.000 g por 2 h, los peroxisomas se encontraban en las fracciones 2 a 8.

Una mayor separación de las proteínas asociadas a membranas de peroxisomas fue lograda por el método Fujiki (1982) y Nuttley et al 1990, citado en [4]. El precipitado de la centrifugación a 20.000 g previamente mencionada fue resuspendido en 10 volúmenes de tampóntampón Ti8 (Tris 10mM, pH 8.0 y PINS (1 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 2 μg leupeptina/ml, 2 μg aprotinina/ml, y 0.4 μg pepstatina A/ml)) y separada a 200.000 g por 1 h. El precipitado, con las membranas peroxisomales, fue nuevamente resuspendido en tampón Ti8 y con la adición de carbonato de sodio 0,1 M y una subsiguiente centrifugación a 200.000 g por 1 h, las membranas peroxisomales fueron separadas de las proteínas con las que se encontraban asociadas, pero no de las proteínas integrales de membrana.

Aislamiento de lisosomas (de líneas celulares cultivadas)

Los lisosomas, mitocondrias y peroxisomas poseen densidades muy similares en gradientes de sacarosa; por tanto es preferible evitar este método. En Percoll, son más densos y dicho método resulta en lisosomas con muy poca o nada de contaminación de otros orgánulos.

Las células lavadas son homogeneizadas con 5 ciclos en un homogeneizador en 3 ml de tampón con sacarosa 0,25 M. Una centrifugación de 10 minutos a 800 g precipitará los núcleos intactos y restos celulares y el sobrenadante puede alamacenarse en hielo. El precipitado nuclear puede resuspenderse en 0,5 ml del mismo tampón, recentrifugado como antes y el sobrenadante se junta con el sobrenadante de la primera centrifugación. A esta solución se le añade la solución de stock de Percoll (que contiene sacarosa 0,25 %) y albúmina sérica bovina (ASB) a una concentración final de 20 % (nota: esto puede incrementarse a 27- 35 %) y 0,4 % respectivamente (volumen final 4,5 ml), y se centrifuga por 30 minutos a 36.000 g (nota: esto puede variar de 15.000 g por 60 min a 62.500 g por 40 min). Utilizando un recolector de gradiente, el gradiente es recolectado en fracciones de 0,4 ml y los lisosomas usualmente se encuentran cerca del fondo del gradiente. Para solubilizar mejor los lisosomas e incrementar la recuperación, se añade NP-40 a una concentración final de 0,5 %, previo al centrifugado a 100.000 g por 1-2 h. Pero si se necesitan lor orgánulos intactos, por ej. para ensayos metabólicos, se debe evitar el NP-40 [5].

Aislamiento de melanosomas

Kushimoto et al y Basrur et al utilizaron un gradiente discontinuo de sacarosa en tampón HEPES [6, 7]. Más específicamente, el lisado celular se resuspendió en sacarosa 2 M y se colocó sobre un gradiente discontinuo de sacarosa (1.0, 1.2, 1,4; 1,5; 1,.6; 1,8; 2,0 M). Tras una centrifugación a 100.000 g por 1 h, los melanosomas de estadio temprano (estadio I y II) se recuperaron en la zona aproximada de sacarosa 1,0-1,2 M. Esta fracción enriquecida se purificó aún más en una fracción rica en proteínas y una fracción rica en tirosinasa por electroforesis de flujo libre (EFL) en un aparato Octopus-PZE FFE a 2 ml/h. La EFL se llevó a cabo a 1000-1100 V y ≈110-125 mA utilizando sacarosa 0,25 M en trietanolamina, pH 7,4, con un flujo de elución de 3-4 ml/min [7]. Este procedimiento produjo muestras altamente enriquecidas en melanosomas para análisis de proteómica los cuales identificaron >60 proteínas de melanosoma [6].

Los mismos investigadores desarrollaron otro protocolo que proporciona fracciones melanosomales de alta pureza.. El lisado celular en sacarosa 2 M fue colocado en el fondo de un gradiente discontinuo de sacarosa. Tras una centrifugación a 100.000 g durante 1 h, los melanosomas de estadio temprano, quefueron recuperados en la zona de sacarosa aproximadamente 1 M, se colocaron posteriormente en el medio de un gradiente extendido de sacarosa 0,8, 1,0, y 1,2 M y centrifugados nuevamente de la misma manera. Este paso adicional eliminó por completo la "contaminación" de mitocondrias.

Los melanosomas tardíos (estadio III y IV) también fueron recuperados de la capa de sacarosa 1,8 M, ya al contener una mayor cantidad de melanina son más pesados.

Purificación de exosomas

Welton et al han purificado exosomas a partir del medio de cultivo de la línea celular HT1376 [8]. Tras eliminar las células mediante una centrifugación suave (400 g por 10 minutos) y los restos celulares (2000 g por 15 minutos y luego 10.000 g por 30 minutos), el sobrenadante fue sometido a centrifugación de alta velocidad (100.000 g por 2 h) colocándolo encima de una capa de sacarosa en óxido de deuterio (D2O o agua pesada). Tras lavar con PBS, el precipitado contenía los exosomas.

Hogan et al han aislado exosomas a partir de orina con el siguiente método [9]. La muestra de orina se limpió en un primer paso mediante una centrifugación a 15.000 g y pasada a través de un filtro de nylon de 8 μm antes de ser centrifugada nuevamente a 150.000 g por 1 h. El precipitado contenía vesículas tipo exosoma y la proteína de Tamm-Horsfall (PTH o uromodulina), la principal proteína en orina. Para eliminar la PTH, la muestra fue colocada sobre un gradiente discontinuo de sacarosa (5-30 %) en D2O con pH 6.0. Tras centrifugar a 200.000 g por 24 h, el colchón fue recolectado en 14 fracciones iguales. Cada fracción fue diluida entre 5 y 10 veces en PBS y recentrifugada a 15.000 g por 1 h y se recuperaron los precipitados con los exosomas puros.

Extracción de histonas

Las histonas son las proteínas más básicas del ambiente intracelular. Esta es la principal característica utilizada para enriquecer histonas a partir de células o extractos de Xenopus laevis. Resuspendiendo los núcleos intactos y purificados (tal como discutido anteriormente) en ácido sulfúrico 0,2 M (H2SO4), e incubándolos con rotación a 4 °C, la mayoría de las proteínas celulares precipitan mientras que las histonas permanecen solubles y son recuperadas por centrifugación a 16.000 g por 15 minutos [10]. Alternativamente, las histonas cromatinizadas pueden ser extraídas por incubación en NaCl 2,5 M.

Purificación de membranas de Golgi (a partir de hígado de ratón)

Un método para el aislamiento de membranas de Golgi fue el utilizado por Chen et al [11]. Un homogenado de tejido de hígado preparado en un tampón que contenía sacarosa al 0,5 M se colocó encima de sacarosa 0,86 M y éste fue cubierto con sacarosa 0,25 M. Tras una centrifugación a 103.800 g por 60 minutos, las membranas fueron recuperadas en la interfase 0,5-1,3 M y ajustadas a sacarosa 0,5 M.

Aislamiento de centrosomas

Los centrosomas pueden ser aislados a partir de células epiteliales adherentes, pero no en grandes cantidades. Andersen et al utilizaron más de 2 mil millones de células (2x109) [12]. Los núcleos son aislados por lisis hipotónica y los centrosomas son recuperados tras dos pasos de centrifugación. Primero, por centrifugación en un colchón de sacarosa al 50 % y posteriormente, por centrifugación en un gradiente de sacarosa 40 %, 50 % y 70%.

Moritz et al aislaron centrosomas de embriones de Drosophila de la siguiente manera: un homogenado (en tampón BRB80 + KCl 100 mM y sacarosa 14 %) de embriones de 3,5 horas se centrifugó a 1.500 g por 10 minutos y se eliminaron los lípidos . El sobrenadante se utilizó para aislar los centrosomas tras añadir Triton X-100 0,1-0,5 % y sacarosa 50% (concentraciones finales), colocándolo en un gradiente de sacarosa (4 mL de 55 % y 3 mL de 70 %) y centrifugando a 100.000 g por 90 minutos. La mayoría de los centrosomas se acumularon encima del colchón de 70 % [13].

Aislamiento de pseudopodias

Las células migratorias forman una extensión en uno de sus lados, la cual se adherirá a un nuevo sitio y luego tirará el resto del cuerpo celular hacia este nuevo sitio. Esta extensión se denomina pseudópodo. Klemke y colegas [14] han desarrollado un método para aislar pseudópodos de los cuerpos celulares en respuesta a agentes quimiotácticos. Esto se logra utilizando cámaras de migración Transwell ("entre pocillos") en platos de 6 o 24 pocillos. En resumen, se dejan adherir las células al lado superior del filtro, el cual posee pequeños poros de 3 micrones, que son lo suficientemente pequeños como para que la célula completa no pueda pasar. Pero los pseudópodos formados pueden pasar y se adherirán al lado inferior del filtro cuando las células detecten el agente quimiotáctico que ha sido colocado en el compartimento inferior. Posteriormente, las células son fijadas y los pseudópodos o los cuerpos celulares son recolectados por lisis en el tampón de elección [15].

Fraccionamiento de citosol, núcleos, RE liso y rugoso, membrana plasmática, mitocondrias.

Song et al han realizado fraccionamiento subcelular a partir de hígados de ratón, pero este método puede utilizarse también para otros tejidos, con algunas modificaciones [16]. El esquema en la figura 2 resume todo el procedimiento. Resumiendo, el homogenado de hígado se centrifugó a 1.000 g por 10 minutos para separar el precipitado (P1) y la fracción soluble (S1).

Fraccionamiento subcelular Figura 2
Figura 2. Representación esquemática del fraccionamiento subcelular a partir de tejido hepático de ratón de Song et al [16].

El P1 resuspendido en un tampón final conteniendo sacarosa 1,8 M (para las fórmulas completas de los tampones, véanse las publicaciones originales) fue centrifugado a 70.900 g por 90 minutos y dio lugar a un precipitado (P2) con los núcleos de las células hepáticas, que pueden ser almacenados, y una fracción soluble entre la interfase 0,25-1,8 M (S2). S2 fue resuspendida en sacarosa 0,25 M, centrifugada a 1.200 g por 10 minutos, y el precipitado, que contiene las membranas plasmáticas crudas, fue resuspendido en un tampón final conteniendo sacarosa 1,45 M y centrifugado a 68.400 g por 60 minutos. La fracción soluble entre sacarosa 0,25 y 1,45 M fue suplementada con un tampón que contenía sacarosa 0,25 M y recentrifugada a 17.600 g por 10 minutos. El precipitado fue resuspendido en un tampón final con sacarosa 1,35 M y centrifugado a 230.000 g por 60 minutos. La fracción 0,25-1,35 M fue recuperada, diluida con sacarosa 0,25 M y recentrifugada a 4.000 g. El consiguiente precipitado contenía las proteínas de membrana plasmática y fue almacenado.

La fracción soluble S1 fue recentrifugada a 8.000 g por 15 minutos. Esto produjo una fracción insoluble (P5) que contenía mitocondrias crudas y una fracción soluble (S5) que contenía RE (microsomas ligeros y pesados) así como complejo de Golgi.

Después de lavar, el P5 fue resuspendido en 12 ml de una solución con Nycodenz 25 % [17] y colocado en un gradiente discontinuo de Nycodenz (5 ml de 34 % y 8 ml de 30 %) y cubierto con 8 ml de 23 % y 3 ml de 20 %. Tras una centrifugación a 52.000 g por 90 minutos, las mitocondrias fueron recuperadas en la interfase 25-30 %. Esta fracción fue recolectada y diluida en un tampón dando una concentración final de manitol 200 mM y sacarosa 50 mM antes de ser centrifugada a 15.000 g por 20 minutos. El precipitado resultante conteniendo mitocondrias puras fue lavado y almacenado.

La fracción soluble S5 fue centrifugada a 34.000 g por 30 minutos resultando en un precipitado (P6), y una fracción soluble con los microsomas ligeros (S4). S4 fue centrifugado a 124.000 g para separar el citosol, que fue almacenado, de los microsomas (precipitado). El P6 se mezcló con los microsomas ligeros de la centrifugación previa y diluido en un tampón final con sacarosa 0,25 M y CsCl 0,015 M. La solución fue colocada sobre una solución de sacarosa 1,3 M y centrifugada a 237.000 g por 2 horas. Esto separó el RE rugoso (precipitado) de RE liso en la interfase 0,25-1,3 M. Esta fracción soluble fue diluida 1:1 con sacarosa 0,25 M y centrifugada a 124.000 g por 60 minutos. El RE liso se recuperó en el precipitado y se guardó [16].

En el caso de que ninguna literatura haya sido citada, la información sobre la función de las proteínas fue obtenida de la base de datos UniprotKB, de Cell Signaling y de Abcam.

Preguntas frecuentes
¿Cómo aislar cloroplastos a partir de tejidos vegetales?

Suspender el homogenado de tejido vegetal en un medio isotónico (0,35 mol/L de cloruro de sodio o 0,4 mol/L de sacarosa) para minimizar cualquier daño a los cloroplastos. Centrifugar el homogenado a 1000 rpm por 2 minutos para eliminar residuos de tejido y células remanentes. Luego centrífugar a 3000 rpm por 5 minutos para obtener el precipitado de cloroplastos. La centrifugación debe realizarse a 0~5°C.

¿Pueden las mitocondrias aisladas mantener su actividad y funciones fisiológicas?

Sí. Las fuerzas centrífugas no dañan la estructura mitocondrial. Además, el tampón de centrifugado posee un rol protector sobre las mitocondrias.

¿algún protocolo modificado para el fraccionamiento subcelular de tejido o células musculares?

Se ha publicado un protocolo simple y económico para este propósito [18].

Referencias
  1. Mendez J, Stillman B. Chromatin association of human origin recognition complex, cdc6, and minichromosome maintenance proteins during the cell cycle: assembly of prereplication complexes in late mitosis. Mol Cell Biol. 2000;20:8602-12 pubmed
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